尤天庚，謝 岑，杜江波，陳笑艷，鐘大放

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院普外科，上海 200120；2. 中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203)

奮乃靜(perphenazine)為吩噻嗪類多巴胺D2受體阻斷劑，臨床上主要用于治療精神分裂癥、躁狂癥，也可用于治療嘔吐及嚴(yán)重焦慮。Symchowicz等[1]研究了35S-奮乃靜在大鼠體內(nèi)的分布和排泄。皮下注射0.3 mg/kg的35S-奮乃靜后，藥物主要分布在肺、肝、腎、脾和垂體中，24 h內(nèi)超過80%的藥物被排泄，其中的80%經(jīng)糞便排泄，這表明奮乃靜在大鼠體內(nèi)主要經(jīng)膽汁排泄。Eggert等[2]報(bào)道了奮乃靜在人體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)。靜脈注射5 mg奮乃靜后，體內(nèi)有重吸收現(xiàn)象，半衰期約9.5 h，提示奮乃靜在人體內(nèi)可能發(fā)生肝腸循環(huán)。Huang等[3]報(bào)道了奮乃靜在精神分裂癥患者和健康人體內(nèi)的代謝和排泄。尿中主要代謝途徑包括S-氧化、吩噻嗪環(huán)上7位羥基化和葡萄糖醛酸結(jié)合等；在給藥后17周內(nèi)，尿中僅回收了給藥劑量的44%，表明奮乃靜在人體內(nèi)除尿排泄外，尚存在主要排泄途徑未被闡明。因此，為全面地了解奮乃靜在人體內(nèi)的代謝過程，研究其膽汁排泄十分必要。

膽汁排泄能夠顯著影響某些藥物的系統(tǒng)暴露量、藥理作用和毒性。由于人膽汁樣品不易獲得，通常使用受試者糞樣替代，用以研究藥物的膽汁排泄。但是這種方法存在著諸多弊端：首先，該方法無法區(qū)分膽汁排泄和腸道外排過程，對(duì)于口服給藥的藥物，該方法同樣不能區(qū)分未吸收的藥物和吸收后經(jīng)膽汁排泄或者腸道外排的藥物，因此糞樣中藥物及代謝物的劑量和相對(duì)比例并不能真正反映膽汁排泄的情況。另外，一些不穩(wěn)定的代謝物(如葡萄糖醛酸結(jié)合物)可能在腸菌群的作用下發(fā)生降解后排出體外，或者通過腸肝循環(huán)再重吸收進(jìn)入人體循環(huán)，這些過程都將導(dǎo)致糞樣無法準(zhǔn)確地反映藥物的膽汁排泄過程[4-7]。因此，直接研究人膽汁中的代謝物，可以更可靠地確定藥物及其代謝物在肝臟、膽囊和膽道中的暴露情況[8-18]。

膽汁是一種復(fù)雜的生物基質(zhì)，主要組成是膽酸類化合物，相對(duì)分子質(zhì)量約400 Da，與大多數(shù)藥物的相對(duì)分子質(zhì)量接近，其種類和結(jié)構(gòu)的多樣性給膽汁中藥物代謝物的鑒定帶來了巨大挑戰(zhàn)。UPLC/Q-TOF MS結(jié)合了MDF[19]和generic dealkylation技術(shù)[20]，能有效去除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，MSE利用碰撞能量梯度，可同時(shí)完成對(duì)前體離子和產(chǎn)物離子的采集，顯著縮短了分析時(shí)間[21]。本研究利用T管引流技術(shù)收集患者服用奮乃靜片后的膽汁，采用UPLC/Q-TOF MS法快速表征奮乃靜在膽汁中的代謝物，以進(jìn)一步完善奮乃靜在人體內(nèi)的代謝途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

Acquity Ultra超高效液相色譜系統(tǒng)及Synapt Q-TOF質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品， 配有Masslynx V4.1，MetaboLynx及MassFragmentTM數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

1.2 材料與試劑

奮乃靜片：由上海市東方醫(yī)院提供；乙腈、甲酸(色譜純)：德國(guó)Fluka公司產(chǎn)品；醋酸銨(色譜純)：美國(guó)Tedia公司產(chǎn)品；β-葡萄糖苷酸酶：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；枸櫞酸鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；去離子水：由法國(guó)Millipore純水儀制備。

1.3 膽汁樣品采集

對(duì)一名患有精神分裂癥的膽管結(jié)石患者實(shí)施膽管插管手術(shù)后，中、晚各服用4 mg奮乃靜，收集首次給藥后24 h內(nèi)的膽汁樣品，于-20 ℃保存待測(cè)。本實(shí)驗(yàn)按照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局GCP指導(dǎo)原則設(shè)計(jì)方案，并獲得上海東方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)前受試者自愿簽署書面知情同意書。

1.4 分析方法

1.4.1 色譜條件 Acquity UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.8 μm)；柱溫40 ℃；流動(dòng)相： A(5 mmol/L醋酸銨水溶液)，B(0.05%甲酸-乙腈溶液)；流速0.4 mL/min；梯度程序洗脫：0～3 min，5% B，3～16 min，5%～45% B，16～18 min，45% B，18～20 min，45%～100% B，20～25 min，100%～5% B。

1.4.2 質(zhì)譜條件 ESI離子源，正離子方式檢測(cè)，霧化氣(氮?dú)?流量700 L/h，去溶劑溫度350 ℃，離子源溫度120 ℃，毛細(xì)管電壓3.0 kV。低能量掃描時(shí)，傳輸碰撞能量3 eV，阱碰撞能量5 eV；高能量掃描時(shí)，傳輸碰撞能量15 eV，阱碰撞能量15～35 eV。質(zhì)量掃描范圍m/z80～1 000，質(zhì)譜分辨率約為10 000。選取400 μg/L亮氨酸-腦啡肽(m/z556.277 1)作為質(zhì)荷比的外標(biāo)校正(Lock SprayTM，5 μL/min)。

1.5 樣品預(yù)處理

向300 μL膽汁樣品中加入600 μL乙腈，渦流混合1 min，以11 000 r/min離心5 min，取出全部上清液置于10 mL試管中，40 ℃氮?dú)饬飨麓蹈桑瑲埩粑镆?00 μLV(5 mmol/L醋酸銨水溶液)∶V(0.05%甲酸-乙腈溶液)=9∶1的溶液溶解，取10 μL進(jìn)行UPLC/Q-TOF MS分析。

向300 μL膽汁樣品中加入200 μL 2 000 U/mL的β-葡萄糖苷酸酶(由pH 5枸櫞酸鈉緩沖液配制)，37 ℃下水浴溫孵16 h后，迅速冷卻，按1.5預(yù)處理后，進(jìn)行UPLC/Q-TOF MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 奮乃靜對(duì)照品色譜和質(zhì)譜分析

對(duì)奮乃靜對(duì)照品溶液進(jìn)行UPLC/Q-TOF MS分析，利用MSE功能獲得低、高碰撞能量下的質(zhì)譜信息：低碰撞能量下獲得前體離子質(zhì)譜圖，高碰撞能量下獲得產(chǎn)物離子信息。奮乃靜的色譜保留時(shí)間為15.33 min，由于其分子中含有1個(gè)氯原子，也可以通過同位素峰簇輔助解析其裂解途徑。

在低碰撞能量質(zhì)譜圖中，奮乃靜的[M+H]+離子為m/z404/406(C21H27ClN3OS+)。在高碰撞能量質(zhì)譜圖中，主要碎片離子為m/z274/276、246/248、171、143、100、98，示于圖1。m/z171(C9H19N2O+)為前體離子經(jīng)i-斷裂丟失2-氯吩噻嗪(C12H8ClNS)分子后生成的碎片離子，相對(duì)豐度為100%；m/z274/276(C15H13ClNS+)及m/z246/248(C13H9ClNS+)兩對(duì)離子的豐度比均為3∶1，證明碎片離子中含有氯原子，前者為前體離子經(jīng)i-斷裂丟失1-哌嗪乙醇(C6H14N2O)分子生成的碎片離子，后者為前體離子經(jīng)氫重排后丟失4-乙基-1-哌嗪乙醇(C8H18N2O)分子后生成的碎片離子；m/z143(C7H15N2O+)為前體離子經(jīng)氫重排后丟失10-乙基-2-氯吩噻嗪(C14H12ClNS)分子后生成的碎片離子；m/z100(C5H10NO+)為前體離子經(jīng)i-斷裂和多步氫重排后生成的碎片離子；m/z98(C5H10N2+)為前體離子經(jīng)多步重排后生成的碎片離子。

根據(jù)奮乃靜的裂解特點(diǎn)，可將其結(jié)構(gòu)分為A(1-哌嗪乙醇)、B(2-氯吩噻嗪)兩個(gè)片段。代謝物是原形藥物在體內(nèi)經(jīng)酶催化產(chǎn)生的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，與原形藥物具有相似的母核結(jié)構(gòu)，因此根據(jù)原形藥物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，可以推測(cè)代謝物的結(jié)構(gòu)[22]。

圖1 奮乃靜對(duì)照品在高碰撞能量下的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of perphenazine under high collision energy

2.2 人膽汁中的代謝產(chǎn)物鑒定

采用MDF和generic dealkylation等軟件對(duì)MSE數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲得膽汁樣品中代謝物的色譜圖，示于圖2。與空白膽汁樣品的色譜圖比較，在服藥后的人膽汁中主要發(fā)現(xiàn)16對(duì)相關(guān)離子，分別為m/z404/406、376/378、392/394、394/396、418/420、420/422、434/436、436/438、500/502、530/532、552/554、580/582、596/598、610/612、612/614、626/628，每對(duì)離子的豐度比均為3∶1，分別命名為M0～M15。奮乃靜代謝物的準(zhǔn)確分子質(zhì)量、可能元素組成和代謝途徑等列于表1。本工作以?shī)^乃靜的主要代謝產(chǎn)物M5、M12和M15為例，闡述代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定過程。

a. 全圖；b. 8.5～12 min放大圖圖2 服藥后人膽汁中奮乃靜代謝物的色譜圖Fig.2 Chromatograms of perphenazine metabolites in human bile

編號(hào)代謝物測(cè)定值[M+H]+計(jì)算值[M+H]+分子式質(zhì)量偏差/mDa質(zhì)量相對(duì)偏差/10-6保留時(shí)間/minM0-1原形藥物404.157 8404.156 3C21H26ClN3OS1.53.715.33M1-1N-去烷基+羥基化376.125 1376.125 0C19H22ClN3OS0.10.311.77M1-2N-去烷基+羥基化376.128 1376.125 0C19H22ClN3OS3.18.213.54M2-1N-去烷基+雙羥基化392.122 9392.120 0C19H22ClN3O2S2.97.49.46M2-2N-去烷基+雙羥基化392.122 3392.120 0C19H22ClN3O3S2.35.810.09M3+N-去烷基+雙羥基化+還原394.132 3394.135 6C19H24ClN3O2S-3.3-8.410.21M4+羥基化+脫氫418.133 1418.135 6C21H24ClN3O2S-2.5-6.015.03M5-1羥基化420.149 1420.151 3C21H26ClN3O2S-2.2-5.210.16M5-2+羥基化420.152 5420.151 3C21H26ClN3O2S1.22.910.67M5-3羥基化420.152 1420.151 3C21H26ClN3O2S0.81.911.02M5-4羥基化420.151 0420.151 3C21H26ClN3O2S-0.3-0.713.54M6-1++雙羥基化+脫氫434.129 5434.130 5C21H24ClN3O3S-1.0-2.39.70M6-2雙羥基化+脫氫434.130 6434.130 5C21H24ClN3O3S0.10.210.26M6-3雙羥基化+脫氫434.129 1434.130 5C21H24ClN3O3S-1.4-3.212.38M7-1雙羥基化436.145 4436.146 2C21H26ClN3O3S-0.8-1.89.16M7-2雙羥基化436.144 3436.146 2C21H26ClN3O3S-1.9-4.49.35M7-3雙羥基化436.146 8436.146 2C21H26ClN3O3S0.61.410.56M8-1羥基化+硫酸500.105 8500.108 1C21H26ClN3O5S2-2.3-4.610.35M8-2羥基化+硫酸500.1094500.108 1C21H26ClN3O5S21.32.611.49

續(xù)表

編號(hào)代謝物測(cè)定值[M+H]+計(jì)算值[M+H]+分子式質(zhì)量偏差/mDa質(zhì)量相對(duì)偏差/10-6保留時(shí)間/minM9雙羥基化+甲基化+硫酸530.118 2530.118 6C22H28ClN3O6S2-0.4-0.811.30M10-1N-去烷基+羥基化+葡萄糖醛酸552.160 4552.157 1C25H30ClN3O7S3.36.07.74M10-2N-去烷基+羥基化+葡萄糖醛酸552.156 9552.157 1C25H30ClN3O7S-0.2-0.410.39M11+葡萄糖醛酸580.191 4580.188 4C27H34ClN3O7S3.05.214.03M12-1羥基化+葡萄糖醛酸596.180 2596.183 3C27H34ClN3O8S-3.1-5.27.25M12-2+++羥基化+葡萄糖醛酸596.181 0596.183 3C27H34ClN3O8S-2.3-3.99.02M12-3+羥基化+葡萄糖醛酸596.181 7596.183 3C27H34ClN3O8S-1.6-2.710.46M13+雙羥基化+脫氫+葡萄糖醛酸610.162 0610.162 0C27H32ClN3O9S008.06M14雙羥基化+葡萄糖醛酸612.182 9612.178 3C27H34ClN3O9S4.67.510.30M15-1+雙羥基化+甲基化+葡萄糖醛酸626.193 2626.193 9C28H36ClN3O9S-0.7-1.18.88M15-2+雙羥基化+甲基化+葡萄糖醛酸626.196 1626.193 9C28H36ClN3O9S2.23.510.92

注：+++為代謝物比例>20%；++為代謝物比例>10%；+為代謝物比例>5%；未標(biāo)注的表示代謝物比例<5%

2.2.1 M0([M+H]+，m/z404/406)

從MDF色譜圖中選擇性檢測(cè)m/z404/406，在保留時(shí)間為15.33、15.77 min出現(xiàn)2個(gè)色譜峰，命名為M0-1和M0-2，根據(jù)準(zhǔn)確分子質(zhì)量，推測(cè)它們的分子式均為C21H26ClN3OS，M0-1的色譜保留時(shí)間及高能量下的主要碎片離子均與奮乃靜對(duì)照品相同，從而確定M0-1是未被代謝的原形藥物奮乃靜。M0-2的結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步考察。

2.2.2 M5([M+H]+，m/z420/422)

從MDF色譜圖中選擇性檢測(cè)m/z420/422(m/z404/406+16 Da)，在保留時(shí)間為10.16、10.67、11.02、13.54 min出現(xiàn)4個(gè)色譜峰，分別命名為M5-1、M5-2、M5-3和M5-4，根據(jù)準(zhǔn)確分子質(zhì)量，推測(cè)它們的分子式均為C21H26ClN3O2S(原形分子式為C21H26ClN3OS)，比原形多了1個(gè)O。在高碰撞能量下，M5-1和M5-3均產(chǎn)生m/z274/276、246/248、187、159碎片離子，其中m/z274/276和m/z246/248的碎片離子與原形藥物的B片段相同，而m/z187和m/z159的碎片離子均比原形藥物的A片段多16 Da，推測(cè)M5-1和M5-3為M0的A片段羥基化代謝物。而M5-2和M5-4產(chǎn)生了m/z290/292、262/264、171、143、100、98碎片離子，其中m/z171、143、100、98的碎片離子與原形藥物的A片段相同，而m/z290/292、262/264的碎片離子均比原形藥物的B片段多16 Da，推測(cè)M5-2和M5-4為M0的B片段羥基化代謝物。

2.2.3 M12([M+H]+，m/z596/598)

從MDF色譜圖中選擇性地檢測(cè)m/z596/598(m/z404/406+192 Da)，在保留時(shí)間為7.25、9.02、10.46 min出現(xiàn)3個(gè)色譜峰，分別命名為M12-1、M12-2和M12-3，根據(jù)準(zhǔn)確分子質(zhì)量，推測(cè)它們的分子式均為C27H34ClN3O8S(原形分子式為C21H26ClN3OS)，比原形多了C6H8O7。進(jìn)行高碰撞能量下的全掃描質(zhì)譜分析，M12-1、M12-2和M12-3產(chǎn)生m/z420/422、290/292、262/264、171、143、100、98碎片離子。m/z596/598→420/422為中性丟失176 Da葡萄糖醛酸分子；m/z290/292、262/264的碎片離子比原形藥物的B片段多16 Da，而m/z171、143、100、98的碎片離子與原形藥物的A片段相同，推測(cè)M12為M0的B部分羥基化后的葡萄糖醛酸結(jié)合物。膽汁樣品經(jīng)β-葡萄糖苷酸酶水解后，m/z596/598色譜峰消失，M5-2和M5-4的色譜峰明顯增強(qiáng)，故推測(cè)M12為M5-2和M5-4的葡萄糖醛酸結(jié)合物，其提取離子流色譜圖示于圖3。

注：a.M12；b.M12的苷元M5; c.M15; d.M15的苷元N1圖3 人膽汁中奮乃靜代謝物經(jīng)β-葡萄糖苷酸酶水解前后的提取離子流色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms (XICs) of perphenazine metabolites in human bile before and after treatment with β-glucuronidase

2.2.4 M15([M+H]+，m/z626/628)

從MDF色譜圖中選擇性地檢測(cè)m/z626/628(m/z404/406+222 Da)，在保留時(shí)間為8.88、10.92 min出現(xiàn)2個(gè)色譜峰，分別命名為M15-1和M15-2，根據(jù)準(zhǔn)確分子質(zhì)量，推測(cè)它們的分子式均為C28H36ClN3O9S(原形分子式為C21H26ClN3OS)，比原形多了C7H10O8。進(jìn)行高碰撞能量下的全掃描質(zhì)譜分析，M15-1和M15-2產(chǎn)生m/z450/452、292/294、171、143、100、98的碎片離子。m/z626/628→450/452為中性丟失176 Da葡萄糖醛酸分子；m/z450/452的碎片離子比m/z404/406的原形藥物多46 Da，通過準(zhǔn)確分子質(zhì)量分析，推測(cè)其分子式為C22H28ClN3O3S，比原形多CH2O2；m/z171、143、100、98的碎片離子與原形藥物的A片段相同；m/z292/294的碎片離子比原形藥物的B片段多46 Da，推測(cè)m/z450/452碎片離子結(jié)構(gòu)可能為M0的B部分發(fā)生雙羥基化后與甲基結(jié)合，M15-1和M15-2為其葡萄糖醛酸分子結(jié)合代謝物。膽汁樣品經(jīng)β-葡萄糖苷酸酶水解后，m/z626/628色譜峰消失，出現(xiàn)1個(gè)m/z450/452色譜峰，保留時(shí)間為14.10 min，命名為N1，通過準(zhǔn)確分子質(zhì)量分析，推測(cè)其分子式為C22H28ClN3O3S，且在高能量質(zhì)譜圖中觀察到了m/z292/294、171、143、100、98的碎片離子，佐證了上述推斷。

綜合分析色譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，推測(cè)奮乃靜在人體內(nèi)的主要代謝途徑，示于圖4。代謝途徑包括羥基化、脫氫、N-去烷基化、甲基化、硫酸及葡萄糖醛酸結(jié)合等。其中，原形藥物和N-去烷基后雙羥基化代謝物及其II相結(jié)合物、原形藥物羥基化或雙羥基化后脫氫及其II相結(jié)合物、原形藥物雙羥基化并甲基化后的II相結(jié)合物等16種代謝物均為人體內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的奮乃靜代謝物。

圖4 推測(cè)的奮乃靜在人體內(nèi)的主要代謝途徑Fig.4 Proposed major metabolic pathways of perphenazine in humans

3 結(jié)論

本研究采用UPLC/Q-TOF MS結(jié)合MDF和generic dealkylation等軟件技術(shù)，快速檢測(cè)并表征了奮乃靜在人膽汁中的代謝物?；颊呖诜^乃靜后，在人膽汁中共檢測(cè)到29種代謝物，包括16種I相代謝物及13種II相代謝物，主要代謝途徑為羥基化、脫氫、N-去烷基化、甲基化、硫酸及葡萄糖醛酸結(jié)合等，其中16種代謝物為首次報(bào)道的新穎代謝物。本研究鑒定了奮乃靜在人膽汁中的代謝物，并進(jìn)一步完善了奮乃靜在人體內(nèi)的代謝途徑。但是，由于樣品來源有限，本研究?jī)H分析了1名受試者的膽汁樣品，存在一定的局限性，后續(xù)研究可進(jìn)行多樣本分析，以獲得更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

[1] SYMCHOWICZ S, PECKHAM W D, EISLER M, et al. The distribution and excretion of radioactivity after administration of35S-labeled perphenazine (Trilafon) [J]. Biochem Pharmacol, 1962, 11(6): 417-422.

[2] EGGERT H C, ROSTED C T, ELLEY J, et al. Clinical pharmacokinetic studies of perphenazine[J]. Br J Clin Pharmacol, 1976, 3(5): 915-923.

[3] HUANG C L, KURLAND A A. Perphenazine (Tr- ilafon) metabolism in psychotic patients [J]. Arch Gen Psychiatry, 1963, 10(6): 639-646.

[4] GHIBELLINI G, LESLIE E M, BROUWER K L R. Methods to evaluate billary excretion of drugs in humans: An updated review[J]. Mol Pharm, 2006, 3(3): 198-211.

[5] ROLLINS D E, KLAASSEN C D. Biliary excretion of drugs in man[J]. Clin Pharmacokinet, 1979, 4(5): 368-379.

[6] LEVINE W G. Biliary excretion of drugs and other xenobiotics[J]. Ann Rev Pharmacol Toxicol, 1978, 18: 81-96.

[7] KLAASSEN C D, PLAA G L. Biliary excretion of xenobiotics[J]. Crit Rev Toxicol, 1975, 4(1): 1-29.

[8] DU J B, DENG P, CHEN X Y, et al. Characterization of ornidazole metabolites in human bile after intraveneous doses by ultraperformance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J]. Acta Pharma Sin B, 2012, 2(2): 159-167.

[9] TEICHERT J, SOHR R, HENNIG L, et al. Id- entification and quantitation of the n-acetyl-l-cysteine s-conjugates of bendamustine and its sulfoxides in human bile after administration of bendamustine hydrochloride[J]. Drug Metab Dispos, 2008, 37(2): 292-301.

[10] BURCKART G J, STARZL T E, VENKATARAMANAN R, et al. Excretion of cyclosporine and its metabolites in human bile[J]. Transplant Proc, 1986, 18(Suppl 5): 46-49.

[11] CHRISTIANS U, STROHMEYER S, KOWNATZKIJ R, et al. Investigations on the metabolic pathways of cyclosporine: I. Excretion of cyclosporine and its metabolites in human bile-isolation of 12 new cyclosporine metabolites[J]. Xenobiotica, 1991, 21(9): 1 185-1 198.

[12] WANG C P, HARTMAN N R, VENKATARAMANAN R, et al. Isolation of 10 cyclosporine metabolites from human bile[J]. Drug Metab Dispos, 1989, 17(3): 292-296.

[13] VANE F M, BUGG C J, RODRIGUEZ L C. Identification of etretinate metabolites in human bile[J]. Drug Metab Dispos, 1989, 17(3): 275-279.

[14] LUNDAHL A, LENNERNS H, KNUTSON L, et al. Identification of finasteride metabolites in human bile and urine by high-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Drug Metab Dispos, 2009, 37(10): 2 008-2 017.

[15] WANG L F, ZHANG D L, SWAMINATHAN A, et al. Glucuronidation as a major metabolic clearance pathway of14C-labeled muraglitazar in humans: metabolic profiles in subjects with or without bile collection[J]. Drug Metab Dispos, 2005, 34(3): 427-439.

[16] KISANGA E R, MELLGREN G, LIEN E A. Ex- cretion of hydroxylated metabolites of tamoxifen in human bile and urine[J]. Anticancer Res, 2005, 25(6): 4 487-4 492.

[17] LIEN E A, SOLHEIM E, KVINNSLAND S, et al. Identification of 4-hydroxy-n-desmethyltamoxifen as a metabolite of tamoxifen in human bile[J]. Cancer Res, 1988, 48: 2 304-2 308.

[18] DENG P, YOU T G, CHEN X Y, et al. Identification of amiodarone metabolites in human bile by ultraperformance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J]. Drug Metab Dispos, 2011, 39(6): 1 058-1 069.

[19] ZHONG D F, LI X Q, WANG A M, et al. Identification of the metabolites of roxithromycin in humans[J]. Drug Metab Dispos, 2000, 28(5): 552-559.

[20] ZHU M S, MA L, ZHANG D L, et al. Detection and characterization of metabolites in biological matrices using mass defect ltering of liquid chromatography/high resolution mass spectrometry data[J]. Drug Metab Dispos, 2006, 34(10): 1 722-1 733.

[21] MORTISHIRE-SMITH R J, CASTRO-PEREZ J M, YU K, et al. Generic dealkylation: A tool for increasing the hit-rate of metabolite rationalization, and automatic customization of mass defect filters [J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2009, 23(7): 939-948.

[22] BATEMAN K P, CASTRO-PEREZ J M, WRONA M, et al. MSE with mass defect filtering for in vitro and in vivo metabolite identification[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2007, 21(9): 1 485-1 496.

[23] MA S, CHOWDHURY S K, ALTON K B. Application of mass spectrometry for metabolite identification[J]. Curr Drug Metab, 2006, 7(5): 503-523.