表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜法快速鑒別羊肉真?zhèn)?/h1>
2014-08-07 02:22陳煥文郭曉暾楊水平
質(zhì)譜學(xué)報(bào) 2014年6期
李 倩，王 姜，陳煥文，郭曉暾，楊水平
(東華理工大學(xué)，江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330013)
近年來，在暴利驅(qū)使下發(fā)生了多起“摻假羊肉”事件，在損害消費(fèi)者權(quán)益的同時(shí)也給消費(fèi)者帶來了許多安全隱患[1]，因此引起了媒體、人民群眾以及政府的高度關(guān)注。由于制作假羊肉過程中會(huì)添加色素、香精等食品添加劑，而制作者多為沒有經(jīng)過食品加工培訓(xùn)的人員，經(jīng)常會(huì)過量使用添加劑，人們長期食用這種假羊肉會(huì)對(duì)身體造成嚴(yán)重的傷害，甚至誘發(fā)其他疾病。目前，由于制作摻假肉制品水平的提高，感官檢驗(yàn)法[2-3]在一定程度上存在主觀差異性，準(zhǔn)確性不高；免疫學(xué)方法[4-5]、紅外光譜法[6]、PCR[7]方法等分析方法的鑒別效果較好，但樣品制備或操作過程較為復(fù)雜、繁瑣，較難實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，因此在國內(nèi)的應(yīng)用較少。
近幾年興起的快速質(zhì)譜分析方法具有無需樣品預(yù)處理、分析時(shí)間短、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，其中表面解吸常壓化學(xué)電離源(DAPCI)可在常溫、常壓、無解吸溶劑的作用下，對(duì)未經(jīng)樣品預(yù)處理的各種表面痕量物質(zhì)進(jìn)行解吸電離，對(duì)樣品無污染、無破壞，是食品樣品原位質(zhì)譜檢測(cè)較為理想的電離方法之一[8-14]。主成分分析法(PCA)是一種多變量的統(tǒng)計(jì)分析方法，將其與快速質(zhì)譜分析技術(shù)結(jié)合是通過簡化數(shù)據(jù)(即用較少的綜合指標(biāo)代替原來具有一定相關(guān)性的較多指標(biāo))來反映原來多變量的大部分信息[15]，使得質(zhì)譜分析技術(shù)在區(qū)分復(fù)雜樣品時(shí)更能體現(xiàn)其分析時(shí)間短、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[16-17]。本實(shí)驗(yàn)利用表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜法(DAPCI-MS)，在無需樣品預(yù)處理?xiàng)l件下快速鑒別羊肉真?zhèn)?，這對(duì)開展肉制品檢驗(yàn)檢疫工作具有重要意義。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 主要儀器與裝置
LTQ-XL型線性離子阱質(zhì)譜儀：美國Finnigan公司產(chǎn)品，配有Xcalibur2.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；表面解吸常壓化學(xué)電離源：實(shí)驗(yàn)室自制[18-22]。
1.2 主要材料與試劑
鴨肉、牛肉、豬肉、羊肉：購自當(dāng)?shù)爻?，依次?biāo)記為樣品1～4；羊肉香精：購自當(dāng)?shù)丶Q(mào)市場(chǎng)。
樣品5(鴨肉)、樣品6(牛肉)、樣品7(豬肉)、樣品8(羊肉)：購自當(dāng)?shù)丶Q(mào)市場(chǎng)。
假羊肉的制備：向有制作經(jīng)驗(yàn)的相關(guān)人員了解制作方法，按照其提供的方法，先將超市購買的新鮮鴨肉(樣品1)、牛肉(樣品2)及豬肉(樣品3)切成肉片，根據(jù)羊肉香精的使用說明，分別取出約一勺羊肉香精放入A、B、C三組盛有清水的燒杯中，攪拌約5 min，然后分別將鴨肉、牛肉、豬肉片放入A、B、C三組燒杯中泡制，并在泡制過程中不斷攪拌。10 min后，泡制湯料開始沉淀，分別取出各組肉片，標(biāo)記為假羊肉A、假羊肉B和假羊肉C，分開保存。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
設(shè)置LTQ-MS為正離子檢測(cè)模式，掃描范圍m/z50～800，電離電壓3.0 kV，離子傳輸管溫度180 ℃，其他參數(shù)由LTQ-MS系統(tǒng)自動(dòng)優(yōu)化得到。實(shí)驗(yàn)過程無需任何樣品預(yù)處理，將切好的假羊肉A、B、C及樣品1～8的薄片貼在干凈的載玻片上，進(jìn)行質(zhì)譜分析，每種肉樣品分為10組，每組平行測(cè)試6次。測(cè)試完成后，將每個(gè)樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入到Excel中，自變量為質(zhì)荷比(質(zhì)量范圍m/z50～800)，因變量為質(zhì)譜指紋譜圖(MS)的絕對(duì)豐度。最后將這些數(shù)據(jù)導(dǎo)入Matlab中，進(jìn)行PCA計(jì)算并作圖。
2 結(jié)果與討論
2.1 DAPCI-MS總離子流圖分析
按1.3方法分別對(duì)樣品1～8進(jìn)行DAPCI-MS檢測(cè)，其中，羊肉(樣品4)的總離子流圖示于圖1a，羊肉的選擇離子m/z60的離子流圖示于圖1b。從圖1a可見，第一個(gè)顯著信號(hào)峰為空白進(jìn)樣峰，之后的顯著信號(hào)峰為羊肉(樣品4)進(jìn)樣時(shí)出現(xiàn)的峰，從質(zhì)譜儀開始記錄數(shù)據(jù)0 min起，到進(jìn)樣時(shí)間0.1 min之前，總離子流基線較平穩(wěn)，進(jìn)樣后表現(xiàn)為信號(hào)顯著增大并維持在一定水平，進(jìn)樣結(jié)束時(shí)信號(hào)回到基線水平，并且每兩個(gè)顯著信號(hào)峰之間的未進(jìn)樣總離子流基線都保持在一定的基線水平上，說明信號(hào)強(qiáng)度與進(jìn)樣有較好的相關(guān)性。圖1b反應(yīng)了選擇離子m/z60與進(jìn)樣的相關(guān)性，與圖1a相比，圖1b沒有空白進(jìn)樣時(shí)出現(xiàn)的顯著信號(hào)峰，其基線更穩(wěn)定，說明選擇離子m/z60為羊肉樣品中的成分。
注：a. 總離子流圖；b. m/z 60的離子流圖圖1 羊肉(樣品4)的DAPCI-MS總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of mutton (sample 4) by DAPCI-MS
2.2 假羊肉A～C和樣品1～8的DAPCI質(zhì)譜分析
對(duì)樣品1～4和假羊肉A～C進(jìn)行分析的指紋譜圖示于圖2。結(jié)果顯示，由于肉的成分比較復(fù)雜，其中具有較高粘性的大分子物質(zhì)不易被解吸，但不同肉類樣品都含有不同含量的小分子[23-24]，并且較易解吸，因此具有顯著強(qiáng)度的信號(hào)主要集中在m/z50～300區(qū)域。比較各類肉制品的質(zhì)譜圖可以發(fā)現(xiàn)，7種樣品的DAPCI-MS指紋譜圖具有相同的質(zhì)譜信號(hào)峰，但各相同信號(hào)峰的強(qiáng)度卻有著較大的差別。
注：a.鴨肉；b.牛肉；c.豬肉；d.羊肉；e.假羊肉A；f.假羊肉B；g.假羊肉C圖2 鴨、牛、豬、羊肉和假羊肉的DAPCI-MS指紋譜圖Fig.2 DAPCI-MS fingerprint spectrogram of duck，beef，pork，mutton and fake-muttons
鴨肉(樣品1)在m/z50～300范圍內(nèi)的主要峰為m/z70，而m/z70在其他樣品中只檢測(cè)到少量；牛肉(樣品2)在m/z50～300范圍內(nèi)的主要峰為m/z106，在其他樣品中m/z106也只檢測(cè)出少量；豬肉(樣品3)在m/z50～300范圍內(nèi)的主要峰為m/z94，另外還有強(qiáng)度相對(duì)較低的區(qū)別于其他樣品的峰m/z80和m/z122；羊肉(樣品4)在m/z50～300范圍內(nèi)的主要峰為m/z60，同樣在其他樣品中只檢測(cè)出很少量的m/z60；假羊肉A、B、C在m/z50～300范圍內(nèi)，除了具有共同的不同強(qiáng)度信號(hào)峰m/z128、147、164外，還分別具有組成其成分的鴨肉、牛肉和豬肉的主要信號(hào)峰。購自當(dāng)?shù)丶Q(mào)市場(chǎng)的鴨肉(樣品5)、牛肉(樣品6)、豬肉(樣品7)和羊肉(樣品8)的指紋譜圖示于圖3。雖然采集的樣品在生產(chǎn)日期及貯藏時(shí)間等因素上不盡相同，會(huì)導(dǎo)致樣品成分發(fā)生一定的變化，因此檢測(cè)得到的質(zhì)譜峰有所差異，但是同一種屬的樣品之間仍然存在一些相同的物質(zhì)，這一結(jié)論在PCA結(jié)果中得到了一定的反映。
圖3 樣品5～8的DAPCI-MS指紋譜圖Fig.3 DAPCI-MS fingerprint spectrogram of sample 5—8
2.3 羊肉化學(xué)成分的二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析
在DAPCI-MS檢測(cè)羊肉所得的質(zhì)譜圖中，在m/z50～300范圍內(nèi)獲得了較豐富的質(zhì)譜峰。目前，有關(guān)羊肉成分的鑒定已有報(bào)道[25-27]，如，有一定揮發(fā)性的乙酸(m/z60，M+)，絲氨酸(m/z106，MH+)，鳥氨酸(m/z150，M++H2O)等。本研究通過DAPCI離子源結(jié)合主成分分析法實(shí)現(xiàn)快速區(qū)分真假羊肉，因此，選取了有關(guān)羊肉成分報(bào)道中提及相對(duì)較多的m/z150、106等成分進(jìn)行了二級(jí)質(zhì)譜鑒定。
圖4 絲氨酸m/z 106的MS2譜圖 Fig.4 DAPCI-MS/MS spectrum of m/z 106
m/z106物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜圖顯示，母離子m/z106經(jīng)碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)后，產(chǎn)生的主要碎片離子為m/z88、60，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照后，確認(rèn)該離子為絲氨酸，示于圖4。m/z150的二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖5，可以看出，母離子m/z150經(jīng)碰撞誘導(dǎo)裂解后，產(chǎn)生的主要碎片離子為m/z132、122，推測(cè)其裂解機(jī)理為：由于母離子m/z150為自由基陽離子與水的加合物M++H2O，這種加合物形式在DAPCI離子源對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)電離過程中較為常見。M++H2O在CID裂解后，丟失H2O生成M+(m/z132)；丟失C=O生成m/z122的離子，因此初步確認(rèn)m/z150可能為鳥氨酸的水合自由基陽離子。
圖5 鳥氨酸m/z 150的MS2譜圖Fig.5 DAPCI-MS/MS spectrum of m/z 150
2.4 假羊肉A～C和樣品1～8的主成分分析
為了辨別不同的肉類樣品和論證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性，采用PCA對(duì)假羊肉A～C(每種各30個(gè)樣品)和樣品5～8(每種各5個(gè)樣品)在m/z50～800范圍內(nèi)所獲得的DAPCI-MS指紋譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到PCA得分結(jié)果，示于圖6。選擇前3個(gè)主成分用于構(gòu)建模型，表征原始變量的PC1、PC2和PC3的百分比分別為34%、21.7%、12.9%。其中，PC1表征了數(shù)據(jù)集合中最大的變量方向，說明PC1對(duì)于樣品之間的差異具有最好的區(qū)分能力，PC2也說明了對(duì)于樣品之間的差異相對(duì)具有較好的區(qū)分能力，PC1和PC2正確地表示了種類的差異。相同肉類樣品均集中分布在相同區(qū)域內(nèi)，不同肉類樣品可被有效地區(qū)分開。由于動(dòng)物受生存環(huán)境、飲食習(xí)慣或人為因素等影響，不同動(dòng)物肉體中所含的成分有很大差異，所以鴨肉、牛肉、豬肉及羊肉之間能被很好地區(qū)分開來；由于假羊肉A、B、C分別有鴨肉、牛肉和豬肉成分的存在，但經(jīng)過加工后的成分會(huì)發(fā)生變化，所以假羊肉仍然能與鴨肉、牛肉、豬肉和羊肉區(qū)分開。雖然假羊肉A、B、C由不同的肉加工而成，但都處在相對(duì)集中的區(qū)域，可能原因是假羊肉的主要加工原料相同，信號(hào)信息主要來自于加工使用的添加劑，這也是不同的肉加工成的假羊肉具有類似的感官特征的一個(gè)原因。樣品5～8的主要成分分別集中在鴨肉、牛肉、豬肉、羊肉的區(qū)域，這表明相同種屬的不同樣品確實(shí)存在著相同的成分，羊肉能夠被有效地區(qū)分開。同時(shí)，樣品5～8之間也能被有效地區(qū)分開，說明該方法對(duì)實(shí)際樣品有相對(duì)較好的區(qū)分能力。
圖6 假羊肉A～C和樣品1～8的DAPCI-MS數(shù)據(jù)PCA的三維得分結(jié)果Fig.6 3D plots of PCA score results for fake-muttons A—C and sample 1—8
3 結(jié)論
LTQ線性離子阱質(zhì)譜儀的門限時(shí)間最短為0.001 ms，為了提高檢測(cè)的靈敏度和信號(hào)穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定門限時(shí)間為100 ms，CID碰撞解離時(shí)間為30～50 ms，單個(gè)樣品的分析時(shí)間不超過30 s。
結(jié)果表明，采用DAPCI-MS和PCA相結(jié)合的方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同肉類樣品的快速區(qū)分。該方法發(fā)揮了DAPCI-MS無需樣品預(yù)處理、測(cè)定速度快等特點(diǎn)，若能與小型質(zhì)譜儀結(jié)合使用實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速篩查，可有望成為一種高通量、實(shí)時(shí)、在線檢測(cè)復(fù)雜樣品的分析工具，在食品、藥品和環(huán)境等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。
[1] LV X W, WANG J, WU L, et al. Tissue deposition and residue depletion in lambs exposed to melamine and cyanuric acid-contaminated diets[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 58(2)：943-948.
[2] CLAUSEN M R, PEDERSEN B H, BERTRAM H C, et al. Quality of sour cherry juice of different clones and cultivars (PrunuscerasusL.) determined by a combined sensory and NMR spectroscopic approach[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(22)：12 124-12 130.
[3] 馬發(fā)順, 張明秀, 桑曉玲, 等. 羊肉的真?zhèn)舞b別法[J]. 肉品衛(wèi)生, 2002, (4)：23-23. MA Fashun, ZHANG Mingxiu, SANG Xiaoling, et al. Identification method for authenticity of mutton[J]. Meat Hygiene, 2002, (4)：23-23(in Chinese).
[4] LAMETSCH R, ROEPSTORFF P, BENDIXEN E. Identification of protein degradation during post-mortem storage of pig meat[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(20)：5 508-5 512.
[5] 何瑋玲, 黃 明, 張 馳. 食品中肉類成分種屬鑒別技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(3)：304-307. HE Weiling, HUANG Ming, ZHANG Chi. Recent technologycal advances for identification of meat species in food products[J]. Food Science, 2012, 33(3)：304-307(in Chinese).
[6] AL-JOWDER O, KEMSLEY E, WILSON R H. Detection of adulteration in cooked meat products by mid-infrared spectroscopy[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(6)：1 325-1 329.
[7] FAJARDO V, GONZLEZ I, ROJAS M, et al. A review of current PCR-based methodologies for the authentication of meats from game animal species[J]. Trends in Food Science & Technology, 2010, 21(8)：408-421.
[8] CHEN H W, HU B, ZHANG X. Principle and application of ambient mass spectrometry for direct analysis of complex samples[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2010, 38(8)：1 069-1 088.
[9] ZHANG X L, JIA B, HUANG K K, et al. Tracing origins of complex pharmaceutical preparations using surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry[J]. Analytical Chemistry, 2010, 82(19)：8 060-8 070.
[10] LI X, HU B, DING J H, et al. Rapid characterization of complex viscous samples at molecular levels by neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry[J]. Nature Protocols, 2011, 6(7)：1 010-1 025.
[11] 方小偉, 張麗麗, 賈 濱, 等. 表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜法快速篩查劣質(zhì)食用油[J]. 現(xiàn)代科學(xué)儀器, 2011, 94(5)：94-97. FANG Xiaowei, ZHANG Lili, JIA Bin, et al. Rapid screening of inferior quality oils by surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry[J]. Modern Scientific Instruments, 2011, 94(5)：94-97(in Chinese).
[12] 祖文川, 汪 雨, 李冰寧,等. ICP-MS相關(guān)聯(lián)用技術(shù)在食品元素形態(tài)分析中的應(yīng)用及進(jìn)展[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào), 2013, 34(4)：247-256. ZU Wenchuan, WANG Yu, LI Bingning, et al. The application and development of elemental speciation analysis in foods by ICP-MS related hyphenated technique[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2013, 34(4)：247-256(in Chinese).
[13] TAKATS Z, WISEMAN J M, GOLOGAN B, et al. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization[J]. Science, 2004, 306(5 695)：471-473.
[14] 于林芳, 徐 杰, 陳士國, 等. 仿刺參皂苷類化合物的電噴霧負(fù)離子質(zhì)譜裂解規(guī)律研究[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào), 2011, 32(2)：77-81. YU Linfang, XU Jie, CHEN Shiguo, et al. Study on the fragmentation pathways of triterpene glycosides from apostichopus japonicus selenka by negative electrospray ionization mass spectrometry[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2011, 32(2)：77-81(in Chinese).
[15] 李 玉, 俞志明, 宋秀賢. 運(yùn)用主成分分析(PCA)評(píng)價(jià)海洋沉積物中重金屬污染來源[J]. 環(huán)境科學(xué), 2006, 27(1)：137-141. LI Yu, YU Zhiming, SONG Xiuxian. Application of principal component analysis(PCA)for the estimation of source of heavy metal contamination in marine sediments[J]. Environmental Science, 2006, 27(1)：137-141(in Chinese).
[16] CHEN H W, SUN Y P, WORTMANN A, et al. Differentiation of maturity and quality of fruit using noninvasive extractive electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J]. Analytical Chemistry, 2007, 79(4)：1 447-1 455.
[17] ZHU L, YAN J P, ZHU Z Q, et al. Differential analysis of camphor wood products by desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(3)：547-552.
[18] HU B, LAI Y H, SO P K, et al. Direct ionization of biological tissue for mass spectrometric analysis[J]. Analyst, 2012, 137(16)：3 613-3 619.
[19] YANG S P, DING J H, ZHENG J, et al. Detection of melamine in milk products by surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry[J]. Analytical Chemistry, 2009, 81(7)：2 426-2 436.
[20] 朱志強(qiáng), 閆建平, 汪 雨, 等. 表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜快速鑒別樟木制品[J]. 分析化學(xué), 2013, 41(6)：905-910. ZHU Zhiqiang, YAN Jianping, WANG Yu, et al. Surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry for rapid analysis of capmhor wood products[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2013, 41(6)：905-910(in Chinese).
[21] 李建強(qiáng), 賈 濱, 胡 斌, 等. 腎結(jié)石中三聚氰胺的表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜測(cè)定[J]. 分析化學(xué), 2010, 38(9)：1 325-1 328. LI Jianqiang, JIA Bin, HU Bin, et al. Surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry for detection of melamine in kidney stone samples[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry，2010, 38(9)：1 325-1 328(in Chinese).
[22] 丁麗英, 胡 斌, 楊水平, 等. 紡織品中致癌性芳香胺的質(zhì)譜成像[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào), 2010, 31(2)：79-82. DING Liying, HU Bin, YANG Shuiping, et al. Imaging carcinogenic aromatic amines in textiles by surface desorption atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2010, 31(2)：79-82(in Chinese).
[23] 尤 娟, 羅永康, 張巖春, 等. 驢肉主要營養(yǎng)成分及與其它畜禽肉的分析比較[J]. 肉類研究, 2008, (7)：20-22. YOU Juan, LUO Yongkang, ZHANG Yanchun, et al. Nutrition composition of donkey meat and comparison with other livestock and poultry meat[J]. Meat Research, 2008, (7)：20-22(in Chinese).
[24] BARONI M V, PODIO N S, BADINI R G, et al. How much do soil and water contribute to the composition of meat? A case study: Meat from three areas of Argentina[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(20)：11 117-11 128.
[25] VASTA V, RATEL J, ENGEL E. Mass spectrometry analysis of volatile compounds in raw meat for the authentication of the feeding background of farm animals[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(12)：4 630-4 639.
[26] WOOD JD R, NUTE G. Effects of fatty acids on meat quality: A review[J]. Meat Science, 2003, 66(1)：21-32.
[27] MACY R L, NAUMANN H, BAILEY M E. Water-soluble flavor and odor precursors of meat. II. Effects of heating on amino nitrogen constituents and carbohydrates in lyophilized diffusates from aqueous extracts of beef, pork, and lamba[J]. Journal of Food Science, 1964, 29(2)：142-148.
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李 倩，王 姜，陳煥文，郭曉暾，楊水平
(東華理工大學(xué)，江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330013)
近年來，在暴利驅(qū)使下發(fā)生了多起“摻假羊肉”事件，在損害消費(fèi)者權(quán)益的同時(shí)也給消費(fèi)者帶來了許多安全隱患[1]，因此引起了媒體、人民群眾以及政府的高度關(guān)注。由于制作假羊肉過程中會(huì)添加色素、香精等食品添加劑，而制作者多為沒有經(jīng)過食品加工培訓(xùn)的人員，經(jīng)常會(huì)過量使用添加劑，人們長期食用這種假羊肉會(huì)對(duì)身體造成嚴(yán)重的傷害，甚至誘發(fā)其他疾病。目前，由于制作摻假肉制品水平的提高，感官檢驗(yàn)法[2-3]在一定程度上存在主觀差異性，準(zhǔn)確性不高；免疫學(xué)方法[4-5]、紅外光譜法[6]、PCR[7]方法等分析方法的鑒別效果較好，但樣品制備或操作過程較為復(fù)雜、繁瑣，較難實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，因此在國內(nèi)的應(yīng)用較少。
近幾年興起的快速質(zhì)譜分析方法具有無需樣品預(yù)處理、分析時(shí)間短、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，其中表面解吸常壓化學(xué)電離源(DAPCI)可在常溫、常壓、無解吸溶劑的作用下，對(duì)未經(jīng)樣品預(yù)處理的各種表面痕量物質(zhì)進(jìn)行解吸電離，對(duì)樣品無污染、無破壞，是食品樣品原位質(zhì)譜檢測(cè)較為理想的電離方法之一[8-14]。主成分分析法(PCA)是一種多變量的統(tǒng)計(jì)分析方法，將其與快速質(zhì)譜分析技術(shù)結(jié)合是通過簡化數(shù)據(jù)(即用較少的綜合指標(biāo)代替原來具有一定相關(guān)性的較多指標(biāo))來反映原來多變量的大部分信息[15]，使得質(zhì)譜分析技術(shù)在區(qū)分復(fù)雜樣品時(shí)更能體現(xiàn)其分析時(shí)間短、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[16-17]。本實(shí)驗(yàn)利用表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜法(DAPCI-MS)，在無需樣品預(yù)處理?xiàng)l件下快速鑒別羊肉真?zhèn)?，這對(duì)開展肉制品檢驗(yàn)檢疫工作具有重要意義。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 主要儀器與裝置
LTQ-XL型線性離子阱質(zhì)譜儀：美國Finnigan公司產(chǎn)品，配有Xcalibur2.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；表面解吸常壓化學(xué)電離源：實(shí)驗(yàn)室自制[18-22]。
1.2 主要材料與試劑
鴨肉、牛肉、豬肉、羊肉：購自當(dāng)?shù)爻?，依次?biāo)記為樣品1～4；羊肉香精：購自當(dāng)?shù)丶Q(mào)市場(chǎng)。
樣品5(鴨肉)、樣品6(牛肉)、樣品7(豬肉)、樣品8(羊肉)：購自當(dāng)?shù)丶Q(mào)市場(chǎng)。
假羊肉的制備：向有制作經(jīng)驗(yàn)的相關(guān)人員了解制作方法，按照其提供的方法，先將超市購買的新鮮鴨肉(樣品1)、牛肉(樣品2)及豬肉(樣品3)切成肉片，根據(jù)羊肉香精的使用說明，分別取出約一勺羊肉香精放入A、B、C三組盛有清水的燒杯中，攪拌約5 min，然后分別將鴨肉、牛肉、豬肉片放入A、B、C三組燒杯中泡制，并在泡制過程中不斷攪拌。10 min后，泡制湯料開始沉淀，分別取出各組肉片，標(biāo)記為假羊肉A、假羊肉B和假羊肉C，分開保存。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
設(shè)置LTQ-MS為正離子檢測(cè)模式，掃描范圍m/z50～800，電離電壓3.0 kV，離子傳輸管溫度180 ℃，其他參數(shù)由LTQ-MS系統(tǒng)自動(dòng)優(yōu)化得到。實(shí)驗(yàn)過程無需任何樣品預(yù)處理，將切好的假羊肉A、B、C及樣品1～8的薄片貼在干凈的載玻片上，進(jìn)行質(zhì)譜分析，每種肉樣品分為10組，每組平行測(cè)試6次。測(cè)試完成后，將每個(gè)樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入到Excel中，自變量為質(zhì)荷比(質(zhì)量范圍m/z50～800)，因變量為質(zhì)譜指紋譜圖(MS)的絕對(duì)豐度。最后將這些數(shù)據(jù)導(dǎo)入Matlab中，進(jìn)行PCA計(jì)算并作圖。
2 結(jié)果與討論
2.1 DAPCI-MS總離子流圖分析
按1.3方法分別對(duì)樣品1～8進(jìn)行DAPCI-MS檢測(cè)，其中，羊肉(樣品4)的總離子流圖示于圖1a，羊肉的選擇離子m/z60的離子流圖示于圖1b。從圖1a可見，第一個(gè)顯著信號(hào)峰為空白進(jìn)樣峰，之后的顯著信號(hào)峰為羊肉(樣品4)進(jìn)樣時(shí)出現(xiàn)的峰，從質(zhì)譜儀開始記錄數(shù)據(jù)0 min起，到進(jìn)樣時(shí)間0.1 min之前，總離子流基線較平穩(wěn)，進(jìn)樣后表現(xiàn)為信號(hào)顯著增大并維持在一定水平，進(jìn)樣結(jié)束時(shí)信號(hào)回到基線水平，并且每兩個(gè)顯著信號(hào)峰之間的未進(jìn)樣總離子流基線都保持在一定的基線水平上，說明信號(hào)強(qiáng)度與進(jìn)樣有較好的相關(guān)性。圖1b反應(yīng)了選擇離子m/z60與進(jìn)樣的相關(guān)性，與圖1a相比，圖1b沒有空白進(jìn)樣時(shí)出現(xiàn)的顯著信號(hào)峰，其基線更穩(wěn)定，說明選擇離子m/z60為羊肉樣品中的成分。
注：a. 總離子流圖；b. m/z 60的離子流圖圖1 羊肉(樣品4)的DAPCI-MS總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of mutton (sample 4) by DAPCI-MS
2.2 假羊肉A～C和樣品1～8的DAPCI質(zhì)譜分析
對(duì)樣品1～4和假羊肉A～C進(jìn)行分析的指紋譜圖示于圖2。結(jié)果顯示，由于肉的成分比較復(fù)雜，其中具有較高粘性的大分子物質(zhì)不易被解吸，但不同肉類樣品都含有不同含量的小分子[23-24]，并且較易解吸，因此具有顯著強(qiáng)度的信號(hào)主要集中在m/z50～300區(qū)域。比較各類肉制品的質(zhì)譜圖可以發(fā)現(xiàn)，7種樣品的DAPCI-MS指紋譜圖具有相同的質(zhì)譜信號(hào)峰，但各相同信號(hào)峰的強(qiáng)度卻有著較大的差別。
注：a.鴨肉；b.牛肉；c.豬肉；d.羊肉；e.假羊肉A；f.假羊肉B；g.假羊肉C圖2 鴨、牛、豬、羊肉和假羊肉的DAPCI-MS指紋譜圖Fig.2 DAPCI-MS fingerprint spectrogram of duck，beef，pork，mutton and fake-muttons
鴨肉(樣品1)在m/z50～300范圍內(nèi)的主要峰為m/z70，而m/z70在其他樣品中只檢測(cè)到少量；牛肉(樣品2)在m/z50～300范圍內(nèi)的主要峰為m/z106，在其他樣品中m/z106也只檢測(cè)出少量；豬肉(樣品3)在m/z50～300范圍內(nèi)的主要峰為m/z94，另外還有強(qiáng)度相對(duì)較低的區(qū)別于其他樣品的峰m/z80和m/z122；羊肉(樣品4)在m/z50～300范圍內(nèi)的主要峰為m/z60，同樣在其他樣品中只檢測(cè)出很少量的m/z60；假羊肉A、B、C在m/z50～300范圍內(nèi)，除了具有共同的不同強(qiáng)度信號(hào)峰m/z128、147、164外，還分別具有組成其成分的鴨肉、牛肉和豬肉的主要信號(hào)峰。購自當(dāng)?shù)丶Q(mào)市場(chǎng)的鴨肉(樣品5)、牛肉(樣品6)、豬肉(樣品7)和羊肉(樣品8)的指紋譜圖示于圖3。雖然采集的樣品在生產(chǎn)日期及貯藏時(shí)間等因素上不盡相同，會(huì)導(dǎo)致樣品成分發(fā)生一定的變化，因此檢測(cè)得到的質(zhì)譜峰有所差異，但是同一種屬的樣品之間仍然存在一些相同的物質(zhì)，這一結(jié)論在PCA結(jié)果中得到了一定的反映。
圖3 樣品5～8的DAPCI-MS指紋譜圖Fig.3 DAPCI-MS fingerprint spectrogram of sample 5—8
2.3 羊肉化學(xué)成分的二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析
在DAPCI-MS檢測(cè)羊肉所得的質(zhì)譜圖中，在m/z50～300范圍內(nèi)獲得了較豐富的質(zhì)譜峰。目前，有關(guān)羊肉成分的鑒定已有報(bào)道[25-27]，如，有一定揮發(fā)性的乙酸(m/z60，M+)，絲氨酸(m/z106，MH+)，鳥氨酸(m/z150，M++H2O)等。本研究通過DAPCI離子源結(jié)合主成分分析法實(shí)現(xiàn)快速區(qū)分真假羊肉，因此，選取了有關(guān)羊肉成分報(bào)道中提及相對(duì)較多的m/z150、106等成分進(jìn)行了二級(jí)質(zhì)譜鑒定。
圖4 絲氨酸m/z 106的MS2譜圖 Fig.4 DAPCI-MS/MS spectrum of m/z 106
m/z106物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜圖顯示，母離子m/z106經(jīng)碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)后，產(chǎn)生的主要碎片離子為m/z88、60，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照后，確認(rèn)該離子為絲氨酸，示于圖4。m/z150的二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖5，可以看出，母離子m/z150經(jīng)碰撞誘導(dǎo)裂解后，產(chǎn)生的主要碎片離子為m/z132、122，推測(cè)其裂解機(jī)理為：由于母離子m/z150為自由基陽離子與水的加合物M++H2O，這種加合物形式在DAPCI離子源對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)電離過程中較為常見。M++H2O在CID裂解后，丟失H2O生成M+(m/z132)；丟失C=O生成m/z122的離子，因此初步確認(rèn)m/z150可能為鳥氨酸的水合自由基陽離子。
圖5 鳥氨酸m/z 150的MS2譜圖Fig.5 DAPCI-MS/MS spectrum of m/z 150
2.4 假羊肉A～C和樣品1～8的主成分分析
為了辨別不同的肉類樣品和論證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性，采用PCA對(duì)假羊肉A～C(每種各30個(gè)樣品)和樣品5～8(每種各5個(gè)樣品)在m/z50～800范圍內(nèi)所獲得的DAPCI-MS指紋譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到PCA得分結(jié)果，示于圖6。選擇前3個(gè)主成分用于構(gòu)建模型，表征原始變量的PC1、PC2和PC3的百分比分別為34%、21.7%、12.9%。其中，PC1表征了數(shù)據(jù)集合中最大的變量方向，說明PC1對(duì)于樣品之間的差異具有最好的區(qū)分能力，PC2也說明了對(duì)于樣品之間的差異相對(duì)具有較好的區(qū)分能力，PC1和PC2正確地表示了種類的差異。相同肉類樣品均集中分布在相同區(qū)域內(nèi)，不同肉類樣品可被有效地區(qū)分開。由于動(dòng)物受生存環(huán)境、飲食習(xí)慣或人為因素等影響，不同動(dòng)物肉體中所含的成分有很大差異，所以鴨肉、牛肉、豬肉及羊肉之間能被很好地區(qū)分開來；由于假羊肉A、B、C分別有鴨肉、牛肉和豬肉成分的存在，但經(jīng)過加工后的成分會(huì)發(fā)生變化，所以假羊肉仍然能與鴨肉、牛肉、豬肉和羊肉區(qū)分開。雖然假羊肉A、B、C由不同的肉加工而成，但都處在相對(duì)集中的區(qū)域，可能原因是假羊肉的主要加工原料相同，信號(hào)信息主要來自于加工使用的添加劑，這也是不同的肉加工成的假羊肉具有類似的感官特征的一個(gè)原因。樣品5～8的主要成分分別集中在鴨肉、牛肉、豬肉、羊肉的區(qū)域，這表明相同種屬的不同樣品確實(shí)存在著相同的成分，羊肉能夠被有效地區(qū)分開。同時(shí)，樣品5～8之間也能被有效地區(qū)分開，說明該方法對(duì)實(shí)際樣品有相對(duì)較好的區(qū)分能力。
圖6 假羊肉A～C和樣品1～8的DAPCI-MS數(shù)據(jù)PCA的三維得分結(jié)果Fig.6 3D plots of PCA score results for fake-muttons A—C and sample 1—8
3 結(jié)論
LTQ線性離子阱質(zhì)譜儀的門限時(shí)間最短為0.001 ms，為了提高檢測(cè)的靈敏度和信號(hào)穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定門限時(shí)間為100 ms，CID碰撞解離時(shí)間為30～50 ms，單個(gè)樣品的分析時(shí)間不超過30 s。
結(jié)果表明，采用DAPCI-MS和PCA相結(jié)合的方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同肉類樣品的快速區(qū)分。該方法發(fā)揮了DAPCI-MS無需樣品預(yù)處理、測(cè)定速度快等特點(diǎn)，若能與小型質(zhì)譜儀結(jié)合使用實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速篩查，可有望成為一種高通量、實(shí)時(shí)、在線檢測(cè)復(fù)雜樣品的分析工具，在食品、藥品和環(huán)境等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。
[1] LV X W, WANG J, WU L, et al. Tissue deposition and residue depletion in lambs exposed to melamine and cyanuric acid-contaminated diets[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 58(2)：943-948.
[2] CLAUSEN M R, PEDERSEN B H, BERTRAM H C, et al. Quality of sour cherry juice of different clones and cultivars (PrunuscerasusL.) determined by a combined sensory and NMR spectroscopic approach[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(22)：12 124-12 130.
[3] 馬發(fā)順, 張明秀, 桑曉玲, 等. 羊肉的真?zhèn)舞b別法[J]. 肉品衛(wèi)生, 2002, (4)：23-23. MA Fashun, ZHANG Mingxiu, SANG Xiaoling, et al. Identification method for authenticity of mutton[J]. Meat Hygiene, 2002, (4)：23-23(in Chinese).
[4] LAMETSCH R, ROEPSTORFF P, BENDIXEN E. Identification of protein degradation during post-mortem storage of pig meat[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(20)：5 508-5 512.
[5] 何瑋玲, 黃 明, 張 馳. 食品中肉類成分種屬鑒別技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(3)：304-307. HE Weiling, HUANG Ming, ZHANG Chi. Recent technologycal advances for identification of meat species in food products[J]. Food Science, 2012, 33(3)：304-307(in Chinese).
[6] AL-JOWDER O, KEMSLEY E, WILSON R H. Detection of adulteration in cooked meat products by mid-infrared spectroscopy[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(6)：1 325-1 329.
[7] FAJARDO V, GONZLEZ I, ROJAS M, et al. A review of current PCR-based methodologies for the authentication of meats from game animal species[J]. Trends in Food Science & Technology, 2010, 21(8)：408-421.
[8] CHEN H W, HU B, ZHANG X. Principle and application of ambient mass spectrometry for direct analysis of complex samples[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2010, 38(8)：1 069-1 088.
[9] ZHANG X L, JIA B, HUANG K K, et al. Tracing origins of complex pharmaceutical preparations using surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry[J]. Analytical Chemistry, 2010, 82(19)：8 060-8 070.
[10] LI X, HU B, DING J H, et al. Rapid characterization of complex viscous samples at molecular levels by neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry[J]. Nature Protocols, 2011, 6(7)：1 010-1 025.
[11] 方小偉, 張麗麗, 賈 濱, 等. 表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜法快速篩查劣質(zhì)食用油[J]. 現(xiàn)代科學(xué)儀器, 2011, 94(5)：94-97. FANG Xiaowei, ZHANG Lili, JIA Bin, et al. Rapid screening of inferior quality oils by surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry[J]. Modern Scientific Instruments, 2011, 94(5)：94-97(in Chinese).
[12] 祖文川, 汪 雨, 李冰寧,等. ICP-MS相關(guān)聯(lián)用技術(shù)在食品元素形態(tài)分析中的應(yīng)用及進(jìn)展[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào), 2013, 34(4)：247-256. ZU Wenchuan, WANG Yu, LI Bingning, et al. The application and development of elemental speciation analysis in foods by ICP-MS related hyphenated technique[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2013, 34(4)：247-256(in Chinese).
[13] TAKATS Z, WISEMAN J M, GOLOGAN B, et al. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization[J]. Science, 2004, 306(5 695)：471-473.
[14] 于林芳, 徐 杰, 陳士國, 等. 仿刺參皂苷類化合物的電噴霧負(fù)離子質(zhì)譜裂解規(guī)律研究[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào), 2011, 32(2)：77-81. YU Linfang, XU Jie, CHEN Shiguo, et al. Study on the fragmentation pathways of triterpene glycosides from apostichopus japonicus selenka by negative electrospray ionization mass spectrometry[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2011, 32(2)：77-81(in Chinese).
[15] 李 玉, 俞志明, 宋秀賢. 運(yùn)用主成分分析(PCA)評(píng)價(jià)海洋沉積物中重金屬污染來源[J]. 環(huán)境科學(xué), 2006, 27(1)：137-141. LI Yu, YU Zhiming, SONG Xiuxian. Application of principal component analysis(PCA)for the estimation of source of heavy metal contamination in marine sediments[J]. Environmental Science, 2006, 27(1)：137-141(in Chinese).
[16] CHEN H W, SUN Y P, WORTMANN A, et al. Differentiation of maturity and quality of fruit using noninvasive extractive electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J]. Analytical Chemistry, 2007, 79(4)：1 447-1 455.
[17] ZHU L, YAN J P, ZHU Z Q, et al. Differential analysis of camphor wood products by desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(3)：547-552.
[18] HU B, LAI Y H, SO P K, et al. Direct ionization of biological tissue for mass spectrometric analysis[J]. Analyst, 2012, 137(16)：3 613-3 619.
[19] YANG S P, DING J H, ZHENG J, et al. Detection of melamine in milk products by surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry[J]. Analytical Chemistry, 2009, 81(7)：2 426-2 436.
[20] 朱志強(qiáng), 閆建平, 汪 雨, 等. 表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜快速鑒別樟木制品[J]. 分析化學(xué), 2013, 41(6)：905-910. ZHU Zhiqiang, YAN Jianping, WANG Yu, et al. Surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry for rapid analysis of capmhor wood products[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2013, 41(6)：905-910(in Chinese).
[21] 李建強(qiáng), 賈 濱, 胡 斌, 等. 腎結(jié)石中三聚氰胺的表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜測(cè)定[J]. 分析化學(xué), 2010, 38(9)：1 325-1 328. LI Jianqiang, JIA Bin, HU Bin, et al. Surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry for detection of melamine in kidney stone samples[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry，2010, 38(9)：1 325-1 328(in Chinese).
[22] 丁麗英, 胡 斌, 楊水平, 等. 紡織品中致癌性芳香胺的質(zhì)譜成像[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào), 2010, 31(2)：79-82. DING Liying, HU Bin, YANG Shuiping, et al. Imaging carcinogenic aromatic amines in textiles by surface desorption atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2010, 31(2)：79-82(in Chinese).
[23] 尤 娟, 羅永康, 張巖春, 等. 驢肉主要營養(yǎng)成分及與其它畜禽肉的分析比較[J]. 肉類研究, 2008, (7)：20-22. YOU Juan, LUO Yongkang, ZHANG Yanchun, et al. Nutrition composition of donkey meat and comparison with other livestock and poultry meat[J]. Meat Research, 2008, (7)：20-22(in Chinese).
[24] BARONI M V, PODIO N S, BADINI R G, et al. How much do soil and water contribute to the composition of meat? A case study: Meat from three areas of Argentina[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(20)：11 117-11 128.
[25] VASTA V, RATEL J, ENGEL E. Mass spectrometry analysis of volatile compounds in raw meat for the authentication of the feeding background of farm animals[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(12)：4 630-4 639.
[26] WOOD JD R, NUTE G. Effects of fatty acids on meat quality: A review[J]. Meat Science, 2003, 66(1)：21-32.
[27] MACY R L, NAUMANN H, BAILEY M E. Water-soluble flavor and odor precursors of meat. II. Effects of heating on amino nitrogen constituents and carbohydrates in lyophilized diffusates from aqueous extracts of beef, pork, and lamba[J]. Journal of Food Science, 1964, 29(2)：142-148.
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