李君 馮高科 鄭曉新 盧釗 秦超師 陳燕 肖建民 夏金喜 翟健坤 吳天根蔣學(xué)俊 李曉艷

藥物洗脫支架(drug-eluting stent，DES)是目前臨床上冠狀動脈介入治療的主要手段，可將支架內(nèi)再狹窄發(fā)生率有效控制在10% 左右［1］。但由于DES 表面攜帶的藥物紫杉醇或西羅莫司，在阻止平滑肌細(xì)胞增生的同時，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞再生，使損傷的內(nèi)皮細(xì)胞推遲愈合，且支架的框架結(jié)構(gòu)是金屬，將永久留存于血管內(nèi)，可誘發(fā)炎癥反應(yīng)及高敏反應(yīng)，增加遠(yuǎn)期支架內(nèi)血栓發(fā)生風(fēng)險，嚴(yán)重威脅患者生命［2-3］。基于此，研發(fā)重點開始轉(zhuǎn)向生物全降解支架的方向。雅培公司的生物全降解藥物洗脫支架(BVS)是世界上首款得到歐洲CE 認(rèn)證允許上市的生物全降解支架，骨架為聚左旋乳酸(poly-L-lactic acid，PLLA)，具有與金屬支架相當(dāng)?shù)膹较驈?qiáng)度，支架置入后即刻血管回縮小。在ABSORB 臨床實驗中證實了BVS 支架的療效，但2 年血管內(nèi)超聲(IVUS)隨訪檢查發(fā)現(xiàn)，支架的急性回縮和支架降解過程中對血管支撐力的減弱仍可能使管腔直徑縮小，且有1 例支架在體內(nèi)降解過程中發(fā)生斷裂［4］。所以，如何提高以生物材料為支架框架結(jié)構(gòu)的徑向支撐力，減少生物支架的彈性回縮，仍是生物全降解支架研發(fā)亟需解決的問題之一。

本實驗中的新型生物全降解支架骨架由PLLA構(gòu)成，并在PLLA 本體基礎(chǔ)上均勻融入特殊納米材料無定形磷酸鈣(amorphic calcium phosphate，ACP)。ACP 融入支架本體內(nèi)，在一定程度上提高了支架的力學(xué)性能。有文獻(xiàn)報道，在生物可降解材料中加入ACP 可中和生物材料降解過程中產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物，減少酸性刺激，一定程度上抑制內(nèi)膜增生［5-6］。本課題組前期工作通過將PLLA/ACP 新型生物支架置入小型豬冠狀動脈內(nèi)，1 個月后病理形態(tài)學(xué)證實未引起支架置入部位血管周圍組織的炎癥反應(yīng)，能夠促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)，從生物相容性方面證實了PLLA/ACP 材料在血管內(nèi)的可行性［7］。本研究將PLLA/ACP 新型生物全降解支架置入實驗動物體內(nèi)，進(jìn)一步探討該支架置入小型豬冠狀動脈內(nèi)后，6 個月內(nèi)防止血管彈性回縮的有效性。

材料與方法

1. 材料與實驗動物:(1)支架。本研究所采用的新型生物全降解支架由東莞天天向上醫(yī)療科技有限公司提供，直徑×長度=3.0 mm ×13.0 mm，以PLLA/ACP 構(gòu)建支架本體材料，將特定劑量抗增殖藥物紫杉醇涂層于支架材料表面，構(gòu)成該新型支架(圖1)。(2)動物。健康實驗用西藏小型豬16 只，12 ～20 月齡，體重25 ～30 kg，雌雄不限(購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，實驗期間專業(yè)飼養(yǎng)人員予以商品飼料和清潔水飼養(yǎng)，術(shù)前常規(guī)喂養(yǎng)，并于術(shù)前5 d 給予口服氯吡格雷(深圳信立泰股份有限公司)75 mg/d，阿司匹林(拜耳醫(yī)藥保健有限公司)300 mg/d。動物實驗遵照武漢大學(xué)實驗動物倫理委員會章程施行。

圖1 支架圖片

2. 支架置入術(shù):實驗動物術(shù)前禁食12 h，以氯胺酮(福建古田藥業(yè)有限公司)10 mg/kg、東莨菪堿(江蘇貝達(dá)科技醫(yī)藥有限公司)0.3 mg 及咪達(dá)唑侖注射液(宜昌人福藥業(yè)股份有限公司)2 mg耳后肌內(nèi)注射進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉。術(shù)中以0.9%氯化鈉注射液200 ml+丙泊酚注射液(西安立邦制藥)200 mg +氯胺酮注射液200 mg 靜脈滴注，維持麻醉。直視下逐層分離右側(cè)股動脈，置入6 F 動脈鞘同時給予肝素(天津生物化學(xué)制藥有限公司)6000 U。沿導(dǎo)絲送入造影管，鉤掛于冠狀動脈，行多體位造影(對比劑為泛影葡胺，西安立邦制藥)，選擇左前降支、左回旋支以及右冠狀動脈血管中較為平直的血管段作為支架置入部位，引導(dǎo)管至相應(yīng)冠狀動脈，應(yīng)用高壓球囊以10 ～14 atm(1 atm =101.325 kPa)擴(kuò)張20 ～25 s，1 ～2 次后進(jìn)行支架釋放。退出球囊后重復(fù)冠狀動脈造影，無血管夾層和血栓形成，前向血流心肌梗死溶栓試驗(TIMI)Ⅲ級為手術(shù)成功。整個過程嚴(yán)格無菌操作。術(shù)后給予青霉素(哈藥集團(tuán)制藥總廠)肌內(nèi)注射，并繼續(xù)口服氯吡格雷75 mg/d，阿司匹林300 mg/d，1 個月后，改為氯吡格雷75 mg/d，阿司匹林100 mg/d，直到實驗終點。

3. 冠狀動脈造影檢查:于小型豬隨訪終點時分別復(fù)查冠狀動脈造影，方法同前。評估支架置入段冠狀動脈通暢程度、有無血栓形成、支架內(nèi)狹窄等情況。

4. IVUS 檢查和定量分析:支架置入術(shù)后即刻、1 個月及6 個月時分別行IVUS 檢查。先經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注入硝酸甘油200 μg，隨后將IVUS 導(dǎo)管送入目標(biāo)血管支架遠(yuǎn)端5 mm，緩慢自動回撤IVUS 導(dǎo)管(0.5 mm/s)，IVUS 導(dǎo)管為機(jī)械旋轉(zhuǎn)型導(dǎo)管，可以5 幀/s 的速度成像。所有IVUS 影像資料均記錄保存，并由獨立于本研究的分析人員進(jìn)行分析。定量分析支架面積、直徑。支架面積定義為支架梁管腔面所圍繞的面積。支架平均面積、直徑分別定義為支架內(nèi)近、中、遠(yuǎn)段各取一個截面所得支架面積、直徑的平均值。支架貼壁不良定義為至少一個支架梁與血管壁發(fā)生顯著分離，支架后方存在閃爍的血流相，且發(fā)生部位無分支血管。

5. 組織形態(tài)學(xué)觀察:在支架置入術(shù)后1 個月、6 個月完善影像學(xué)檢查后處死實驗動物(其中術(shù)后1 個月、6 個月分別處死12 只、4 只)，迅速取出心臟以0.9%肝素生理鹽水高壓灌注直至灌流液清亮，再以10%甲醛溶液高灌注至心臟組織完全固定。分離支架置入部位血管并以石蠟包埋切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，低倍光學(xué)顯微鏡(×10)下觀察血管內(nèi)膜狹窄情況和支架貼壁情況。

6. 統(tǒng)計學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以 珋x ±s 表示，采用t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 一般情況:所有實驗豬均正常存活至實驗結(jié)束。實驗過程中的口服藥物及行冠狀動脈支架置入術(shù)后對動物攝食、活動等一般情況無影響。

2. 冠狀動脈造影結(jié)果:所有實驗豬共成功置入16 枚支架，支架經(jīng)球囊擴(kuò)張后均達(dá)到預(yù)定的擴(kuò)張直徑，隨訪終點造影復(fù)查可見，所有支架置入段血管血流通暢，TIMI 血流Ⅲ級，無管壁夾層、充盈缺損及血栓形成等現(xiàn)象(圖2)。

圖2 新型生物支架置入術(shù)后即刻造影(A)與術(shù)后6 個月造影(B)結(jié)果，支架置入段血管通暢，TIMI Ⅲ級

3. IVUS 分析結(jié)果:支架置入術(shù)后即刻、1 個月、6 個月分別行IVUS 檢測，新型生物支架的支架梁均與血管壁緊密貼合，未見支架貼壁不良征象。術(shù)后1 個月和6 個月隨訪時，血管壁內(nèi)可見內(nèi)膜增生。支架置入部位的近、中、遠(yuǎn)段支架面積和直徑在術(shù)后1 個月及6 個月時與術(shù)后即刻相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0. 05);術(shù)后1 個月、6 個月平均支架面積和平均支架直徑與術(shù)后即刻相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義［平均支架面積:(6. 08 ±1. 30)mm2、(6. 00 ±0. 60)mm2比(5. 97 ± 0. 53)mm2，P ＞0. 05;平 均 支 架 直 徑:(2. 76 ±0. 30)mm、(2. 76 ± 0. 14)mm 比(2. 75±0. 12)mm，P ＞0. 05］(表1、圖3)。

表1 血管內(nèi)超聲測量結(jié)果(珋x±s)

圖3 血管內(nèi)超聲結(jié)果 新型支架置入術(shù)后即刻(A)、1 個月(B)及6 個月(C)后血管內(nèi)超聲結(jié)果，未見支架貼壁不良征象，未見支架彈性回縮情況，箭頭所示為支架梁

4. 組織形態(tài)學(xué)結(jié)果分析:新型生物支架置入術(shù)后1 個月及術(shù)后6 個月行支架置入部位血管標(biāo)本進(jìn)行HE 染色，光鏡下(×10 倍)均未見支架段冠狀動脈管壁壞死、嗜酸細(xì)胞浸潤或管腔內(nèi)血栓形成，支架貼壁良好，血管僅有輕度狹窄(圖4)。

圖4 新型支架置入術(shù)后1 個月(A)及6 個月(B)病理形態(tài)學(xué)結(jié)果(×10 倍)

討 論

PLLA 是目前生物組織工程運用最為廣泛、生物性能和力學(xué)性能較好的新型生物材料［8］。要將PLLA 材料作為血管內(nèi)生物支架的原材料，需克服兩大技術(shù)瓶頸的制約。(1)PLLA 在體內(nèi)降解過程中產(chǎn)生的酸性代謝產(chǎn)物沉積于血管壁，引起置入部位顯著的炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致內(nèi)膜增生。(2)生物支架的支撐力不足問題，生物支架在體內(nèi)降解過程中，存在對血管壁支撐力下降甚至支架斷裂的風(fēng)險［9］。故以PLLA 作為新型生物全降解支架的主體材料，其在血管內(nèi)的生物相容性及物理支撐性兩方面的創(chuàng)新或改進(jìn)仍是當(dāng)今組織工程學(xué)研究領(lǐng)域的重點。

本研究創(chuàng)新采用PLLA 與納米顆粒ACP 兩種原材料，通過擠壓和激光雕刻工藝制成了新型生物全降解支架。ACP 是采用濕化學(xué)法合成羥基磷灰石時出現(xiàn)的磷酸鈣的一種無定形中間相，與磷灰石具有相似的結(jié)構(gòu)單元。磷灰石是人體和動物骨骼的主要無機(jī)成分，具有良好的生物活性、生物相容性和化學(xué) 穩(wěn) 定 性［10］。PLLA/ACP 復(fù)合材料在骨和軟骨組織工程支架材料中有著廣泛的應(yīng)用［11］。ACP 在降解過程中產(chǎn)生的堿性物質(zhì)可中和PLLA 降解過程中產(chǎn)生的酸性代謝產(chǎn)物，并可調(diào)節(jié)生物支架的降解速率，同時復(fù)合材料的力學(xué)性能也有所提高。本課題組前期體外實驗將PLLA/ACP 支架和未加入ACP 的PLLA 支架放入杜氏磷酸鹽緩沖液中降解，并在6 周、3 個月及6個月時對支架的徑向支撐力進(jìn)行檢測。實驗表明，PLLA/ACP 支架在6 個月內(nèi)降解過程中，均有比單純PLLA 支架更高的支撐力，證實ACP 可提高PLLA的力學(xué)支撐性能［12］。

本實驗將PLLA/ACP 新型生物全降解支架置入小型豬冠狀動脈后，對小型豬隨訪終點時行支架置入段血管造影及IVUS 檢查，并取材行病理形態(tài)學(xué)檢測分析，對術(shù)后1 個月未處死的4 只小型豬復(fù)查IVUS 檢查。造影結(jié)果顯示，支架置入即刻擴(kuò)張良好，隨訪終點造影復(fù)查可見所有支架置入段血管血流通暢，TIMI 血流Ⅲ級。由于評估支架本身彈性回縮最好的檢查是IVUS，其能排除增生內(nèi)膜影響，可評價支架貼壁情況，通過測量支架平均面積的方法評估支架彈性回縮［13］。本實驗結(jié)果顯示，隨訪各時間點，支架梁均與血管壁緊密結(jié)合，支架梁后未見閃爍的血流相。支架段血管面積、直徑在術(shù)后1 個月、6 個月分別與術(shù)后即刻相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示本新型支架在6 個月內(nèi)的徑向支撐性能穩(wěn)定，未見支架顯著塌縮。另外，在術(shù)后1 個月及6 個月時進(jìn)行的支架置入血管段病理形態(tài)學(xué)分析顯示，血管內(nèi)膜均有少量增生，管腔僅存在輕度狹窄，且支架貼壁良好，故本研究結(jié)果證實了造影及IVUS 的分析結(jié)果，具有可信性。與本課題組前期體外實驗結(jié)果相呼應(yīng)，將ACP 通過納米顆粒技術(shù)融入PLLA聚合物內(nèi)可顯著增強(qiáng)復(fù)合材料的物理支撐性能，分析其可能機(jī)制為ACP 可限制PLLA 聚合物分子鏈的空間移動性，保證PLLA 分子鏈空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，由此提高了支架梁的徑向支撐力。另外，ACP 提高了PLLA/ACP 復(fù)合材料在降解過程中的結(jié)晶度，由于聚合物材料的物理性能主要取決于聚合物分子質(zhì)量和晶體結(jié)晶度，提高復(fù)合材料的晶體結(jié)晶度亦可提高復(fù)合材料的物理支撐性能［14］。所以，本實驗新型支架融入ACP 提高了支架復(fù)合材料結(jié)晶度，保證支架在體內(nèi)降解過程中具有穩(wěn)定的物理性能，達(dá)到防止血管回縮的目的。

綜上所述，融入ACP 的PLLA 聚合物材料支架不僅能減輕聚合物材料在體內(nèi)降解所產(chǎn)生的酸性代謝產(chǎn)物所致的非炎癥反應(yīng)，促進(jìn)支架置入術(shù)后損傷內(nèi)皮的修復(fù)，并且在一定程度上提升了聚合物材料的力學(xué)性能，無論是體外降解實驗，還是支架置入動物實驗，在長達(dá)6 個月的時間內(nèi)，均能對血管壁提供良好的支撐作用。

但本研究動物樣本量較少，觀察時間點尚不能完全覆蓋本研究支架完全降解的全過程，不能證明支架在血管內(nèi)6 個月后的力學(xué)支撐性能和組織相容性。且本研究未設(shè)置不融入ACP 材料的單純PLLA支架作為對照組，亦未設(shè)置ACP 和PLLA 不同濃度配方比及攜帶紫杉醇藥物不同質(zhì)量比的支架作為對照，具有局限性。但基于本研究初步結(jié)果，樣本量更大、支架置入術(shù)后觀察時間更長、且具有多個不同比例ACP/PLLA 作為對照組的動物體內(nèi)實驗研究已經(jīng)開始進(jìn)行。并且同金屬支架的對比試驗也即將開展，為未來臨床試驗提供有力的技術(shù)支持。

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