楊震發(fā), 袁呈山, 楊順義*, 柳利龍, 楊晉偉, 沈慧敏

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,蘭州 730070；2.蘭州大學(xué) 功能有機(jī)分子化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730000)

黃花棘豆抑制植物病原菌的活性成分研究

楊震發(fā)1, 袁呈山2, 楊順義1*, 柳利龍1, 楊晉偉2, 沈慧敏1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,蘭州 730070；2.蘭州大學(xué) 功能有機(jī)分子化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730000)

為了測(cè)定黃花棘豆(OxytropisochrocephalaBunge)提取物對(duì)常見病原真菌的活性，明確其中的有效成分，以黃花棘豆為材料，結(jié)合生物活性追蹤法，對(duì)黃花棘豆的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行分離，并利用現(xiàn)代波譜學(xué)技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果表明，黃花棘豆乙醇提取物對(duì)供試4種病原真菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性，10 mg/mL對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌率達(dá)到82.08 %；粗提物萃取后的二氯甲烷相和乙酸乙酯相為其活性部分，10 mg/mL對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌率分別為84.30 %和83.13 %；從合并后的二氯甲烷和乙酸乙酯相中分離、鑒定得到了6個(gè)化合物，其中3-羥基-4,9-二甲氧基紫檀烷、3-羥基-9-甲氧基紫檀烷和3-羥基-8,9-二甲氧基紫檀烷對(duì)供試病原菌表現(xiàn)較好的抑制活性；3-羥基-4,9-二甲氧基紫檀烷對(duì)番茄灰霉病菌的EC50值為10.42 μg/mL,3-羥基-8,9-二甲氧基紫檀烷對(duì)黃瓜枯萎病菌的EC50值為27.09 μg/mL。黃花棘豆提取物對(duì)病原真菌具有較好的抑制活性，紫檀烷類化合物為其主要的活性成分，具備進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用的潛力。

黃花棘豆; 活性跟蹤; 分離鑒定; 抑菌成分; 紫檀烷

化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用帶來(lái)了有害生物的抗藥性、殘留毒性及環(huán)境污染等問(wèn)題[1]。隨著人類可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的實(shí)施，符合健康、環(huán)保、持續(xù)發(fā)展理念的高效、低毒、低殘留、與環(huán)境相融的農(nóng)藥成為當(dāng)今農(nóng)藥研究開發(fā)的主題[2-3]。與化學(xué)農(nóng)藥相比，植物源農(nóng)藥具有選擇性高、低毒、易降解、有害生物不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)[4]。據(jù)報(bào)道，在中國(guó)有1 600種重要的作物有害生物，其中約720種是病原物，占近45%，殺菌劑的研究開發(fā)任重道遠(yuǎn)，繼續(xù)尋找高活性的植物源殺菌劑是新農(nóng)藥開發(fā)及植物病害防治的重要基礎(chǔ)工作[5-6]。黃花棘豆(OxytropisochrocephalaBunge)是豆科棘豆屬多年生草本有毒植物[7]，化學(xué)成分主要包括黃酮類、三萜類、生物堿類、糖類等，主要具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、免疫抑制、清除和誘導(dǎo)自由基活性等藥理作用[8-9]。曹光榮等[10]從黃花棘豆中分離出吲哚茲定生物堿-苦馬豆素，并證實(shí)這種生物堿對(duì)α-甘露糖甙酶有抑制作用，是引起羊中毒的主要原因。鄧建梅等[11]對(duì)12種有毒植物化感作用的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，黃花棘豆的甲醇提取物對(duì)油菜、燕麥和反枝莧的幼苗生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用。李翔等[12]對(duì)黃花棘豆化感作用機(jī)理的研究中發(fā)現(xiàn)，黃花棘豆水提液對(duì)燕麥和油菜幼苗的有絲分裂有抑制作用。黃花棘豆對(duì)常見病原真菌活性方面還沒有研究報(bào)道。本試驗(yàn)利用活性追蹤法，研究黃花棘豆對(duì)常見植物病原真菌的抑制活性，并從活性部位中分離活性物質(zhì)，以期明確黃花棘豆中的抑菌活性成分及對(duì)其敏感的病原真菌，為開發(fā)利用該種植物資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試植物

黃花棘豆于2011年7月采自甘肅省武威天祝縣天然草地。選用生長(zhǎng)良好的開花期黃花棘豆全株，陰涼處晾干，剪碎后密封，置于0～4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試菌種

番茄灰霉病菌(BotrytiscinereaPers.exFr.)、馬鈴薯絲核病菌(RhizoctoniasolaniKühn)、黃瓜枯萎病菌(FusariumoxysporumSchl.)、番茄早疫病菌[Alternariasolani(EllisetMartin) JonesetGrout]和小麥根腐菌[Bipolarissorokiniana(Sacc.) Shoem]等，均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 儀器與試劑

Bruker AV-400型核磁共振儀；薄層層析硅膠GF254、柱層析色譜硅膠HF254(200～300 目、300～400 目)(青島海洋化工廠生產(chǎn))；MCI(日本三菱化學(xué)品公司)；Sephadex LH-20(德國(guó)默克公司)；LDZX-30 kBS高壓蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；R205B型、R502型旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；ZRD-5030型全自動(dòng)型鼓風(fēng)干燥箱(上海智域分析儀器制造有限公司)；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、甲醇、丙酮等均為分析純。50%多菌靈可濕性粉劑(江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃花棘豆提取溶劑及敏感菌的篩選

以乙醇和丙酮作為提取溶劑，以番茄灰霉病菌、馬鈴薯絲核病菌、黃瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌和小麥根腐菌作為供試菌，不同溶劑提取物對(duì)不同病原真菌進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，通過(guò)對(duì)比篩選出最適提取溶劑和最敏感病原菌。

1.2.2 黃花棘豆活性物質(zhì)的提取及初步分離

稱取自然干燥的黃花棘豆全株8.6 kg，適當(dāng)粉碎后，用95%乙醇加熱提取3次(溫度控制在40 ℃左右)，每次3 d，提取液減壓濃縮得820 g浸膏，取少量浸膏用乙醇溶解定容至濃度為10.0 mg/mL。將剩余的浸膏溶解于1.5 L水中，依次用石油醚(30～60 ℃,1.0 L)、二氯甲烷(1.0 L)、乙酸乙酯(1.0 L)、正丁醇(1.0 L)萃取3次，3次萃取液合并后進(jìn)行減壓濃縮，得到石油醚部分浸膏(106.4 g)、二氯甲烷部分浸膏(85.6 g)、乙酸乙酯部分浸膏(92.0 g)、正丁醇部分浸膏(125.2 g)，分別取4個(gè)相的浸膏少許，后用相應(yīng)溶劑溶解定容至濃度為10 mg/mL，在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 黃花棘豆抑菌成分的分離鑒定

黃花棘豆的4個(gè)萃取相經(jīng)抑菌活性追蹤發(fā)現(xiàn)，二氯甲烷相和乙酸乙酯相對(duì)番茄灰霉菌的活性明顯高于石油醚相和正丁醇相。合并的二氯甲烷相和乙酸乙酯相進(jìn)行硅膠柱層析(200～300目，石油醚∶丙酮=100∶1…1∶1,0∶1和甲醇)梯度洗脫，TLC檢測(cè)合并得到6個(gè)組分Fr.1(22.6 g)、Fr.2(18.3 g)、Fr.3(32.5 g)、Fr.4(27.1 g)、Fr.5(30.2 g)、Fr.6(24.4 g),分別取6個(gè)組分少許后用相應(yīng)溶劑溶解定容至濃度為10.0 mg/mL。對(duì)其中抑菌活性好的組分進(jìn)一步分離，用硅膠柱層析(石油醚/丙酮60∶1…1∶1,0∶1,甲醇)進(jìn)行梯度洗脫，TLC檢測(cè)合并相同組分，分別進(jìn)行Sephadex LH-20(CHCl3/CH3OH 1∶1)柱層析，再用MCI凝膠層析(水∶甲醇=3∶1…1∶5)純化，反復(fù)硅膠(300～400目)柱層析得到化合物1(2.9 mg)、化合物2(13.7 mg)、化合物3(14.8 mg)、化合物4(5.9 mg)、化合物5(17.5 mg)和化合物6(11.4 mg)。

測(cè)熔點(diǎn)，根據(jù)質(zhì)譜、核磁共振圖譜數(shù)據(jù)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)解析化合物的結(jié)構(gòu)。

1.2.4 生物活性測(cè)定方法

生長(zhǎng)速率法[13]，在常溫、無(wú)菌條件下，取1 mL提取液至25 mL刻度試管，對(duì)照組加入等量對(duì)應(yīng)溶解溶劑，再倒入融化的PDA培養(yǎng)基至10 mL，充分混勻后在50～55 ℃時(shí)，倒入90 mm培養(yǎng)皿中制成平板，平板凝固后接入生長(zhǎng)一致的菌餅(d=0.5 cm)。每皿接1個(gè)菌餅，每處理重復(fù)3次，25～27 ℃培養(yǎng)并觀察結(jié)果。用十字交叉法測(cè)量供試真菌菌落生長(zhǎng)直徑，用下述公式計(jì)算抑制率：

菌落直徑(cm)=測(cè)量菌落直徑平均值-0.5;

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 黃花棘豆不同溶劑提取物對(duì)供試菌抑制作用

兩種不同溶劑提取物對(duì)5種供試病原菌表現(xiàn)不同程度的抑制活性，結(jié)果見表1。乙醇提取物對(duì)番茄灰霉菌的抑菌率高于其他供試菌，并且乙醇提取物的活性高于丙酮提取物的活性。兩種提取物對(duì)5種供試病原真菌的活性顯著高于50 %多菌靈可濕性粉劑的活性。由于黃花棘豆乙醇提取物和黃花棘豆丙酮提取物對(duì)番茄灰霉病菌的抑制活性相對(duì)最高且差異不顯著，但是乙醇較丙酮安全、便宜，因此選擇乙醇作為提取溶劑，選擇最敏感的番茄灰霉病菌作為后續(xù)試驗(yàn)供試菌。

表1 黃花棘豆不同溶劑提取物對(duì)供試菌的抑菌作用1)Table 1 Antifungal activity of different solvent extracts from Oxytropis ochrocephala

1) 表中數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示經(jīng)Duncan氏多重比較在P=0.05水平上差異顯著，下同。黃花棘豆提取物濃度為10.0 mg/mL，50%多菌靈可濕性粉劑濃度為0.5 mg/mL(對(duì)照藥劑濃度同表3、表4)。
Data in the table were the means of three replicates; different letters in each column indicate significant difference atP=0.05 by Duncan’s multiple comparison. The same below. The concentration of the extract ofO.ochrocephalawas 10.0 mg/mL and the concentration of 50% carbendazol WP was 0.5 mg/mL(the concentration of the control was described below).

2.2 黃花棘豆乙醇提取物的4個(gè)萃取相對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用

黃花棘豆乙醇提取物的4個(gè)萃取相對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌作用結(jié)果如表2。黃花棘豆乙醇提取物的石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相和正丁醇4個(gè)萃取相中，在濃度為10.0 mg/mL時(shí)，二氯甲烷相和乙酸乙酯相對(duì)番茄灰霉病菌的抑制活性顯著高于石油醚相和正丁醇相，且抑菌率均大于80 %，極顯著高于50 %多菌靈可濕性粉劑，因此二氯甲烷相和乙酸乙酯相為黃花棘豆乙醇提取物的相對(duì)高活性部位。

2.3 二氯甲烷和乙酸乙酯混合相的6個(gè)組分對(duì)番茄灰霉病菌的抑制活性

在3個(gè)不同濃度時(shí)，F(xiàn)r.3組分和Fr.4組分對(duì)番茄灰霉病菌的抑制活性顯著高于其他4個(gè)組分，也顯著高于50 %多菌靈可濕性粉劑，F(xiàn)r.3組分和Fr.4組分對(duì)番茄灰霉病菌的抑制活性差異不顯著，在濃度為10.0 mg/mL時(shí)對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌率最大，分別為81.35 %和80.75 %。因此Fr.3組分和Fr.4組分為二氯甲烷和乙酸乙酯混合相的相對(duì)高活性部位，對(duì)其繼續(xù)進(jìn)行分離研究。

表2 黃花棘豆乙醇提取物的不同萃取相對(duì)番茄灰霉菌的抑菌作用Table 2 Antifungal activity of ethanol extract from Oxytropis ochrocephala againstBotrytis cinerea in different extraction phases and at different concentrations

表3 二氯甲烷和乙酸乙酯混合相的6個(gè)組分在不同處理濃度時(shí)對(duì)番茄灰霉菌的抑制作用Table 3 Antifungal activity of six fractions fromincorporative methylene chloride and ethylacetatephase against Botrytis cinerea at different concentrations

2.4 黃花棘豆抑菌成分鑒定

對(duì)Fr.3和Fr.4兩部分通過(guò)反復(fù)硅膠(300～400 目)柱層析，通過(guò)Sephadex LH-20(CHCl3∶CH3OH=1∶1)柱層析和MCI層析純化，最后分離得到了6個(gè)化合物，通過(guò)理化性質(zhì)、ESI-MS、1H NMR、13C NMR和與文獻(xiàn)對(duì)照的方法，鑒定為:(1)豆甾-5-烯-3β-醇-7-酮、(2)3-羥基-4,9-二甲氧基紫檀烷、(3)3-羥基-9-甲氧基紫檀烷、(4)3β-羥基-羽扇豆烷、(5)3-羥基-8,9-二甲氧基紫檀烷和(6)3β-羥基-12-烯-齊墩果烷。6個(gè)化合物的波譜數(shù)據(jù)如下：

化合物(1):白色無(wú)定形粉末;1H NMR(300 mHz,CDCI3):δ=5.68(1 H,s,H-6),3.68(1 H,m,H-3),2.5(1 H,ddd,J=14.5,5.4,1.8Hz,H-4a),2.39(1 H,m,H-4 b),2.24(1 H,t,J=11.1 Hz,H-8),1.19(3H,s,H-19),0.92(3H,d,J=6.6Hz,H-21),0.85(3H,t,J=7.5Hz,H-29),0.83(3H,d,J=6.6Hz,H-26),0.81(3H,d,J=6.6Hz,H-27),0.66(3H,s,H-18)。查閱文獻(xiàn)[14]并與文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)對(duì)照，確定豆甾-5-烯-3β-醇-7-酮(stigmast-5-en-3β-ol-7-one)的數(shù)據(jù)與上述數(shù)據(jù)基本一致。

化合物(2):無(wú)色柱狀結(jié)晶(CHCl3-MeOH);ESI-MS(+)m/z:300.8(M++1);1H NMR(400 mHz,CDCI):δ=7.13(1H,d,J=8.4Hz,H-1),6.58(1H,d,J=8.4Hz,H-2),3.66(1H,m,H-6a),4.41(1H,d,J=9.2,6.4 Hz,H-6α),3.62(1H,m,H-6β),7.27(1H,d,J=8.0 Hz,H-7),6.49(1H,d,J=8.0,2.4Hz,H-8),6.45(1H,d,J=2.4Hz,H-10),5.58(1H,d,J=6.8 Hz,H-11a),3.72,3.69(3H,s,4-OCH3,9-OCH3),9.40(1H,s,OH-3);13C NMR(100 mHz,CDCI):δ=125.6(C-1),109.9(C-2),135.5(C-3),150.9(C-4),160.5(C-4a),66.1(C-6),40.8(C-6a),119.3(C-6 b),125.2(C-7),105.9(C-8),149.5(C-9),96.3(C-10),160.2(C-10a),78.1(C-11a),112.5(C-11 b),60.1(4-OCH3),55.2(9-OCH3)。查閱文獻(xiàn)[15]并與文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)對(duì)照，確定3-羥基-4,9-二甲氧基紫檀烷的數(shù)據(jù)與上述數(shù)據(jù)基本一致。

化合物(3):棕色粒狀固體(Acetone);ESI-MS(+)m/z:271.2(M++1).1H NMR(400 mHz, CDCI)δ:8.48(3-OH),7.30(1H,d,J=8.5Hz,H-1),7.16(1H,d,J=8Hz,H-7),6.51(1H,dd,J=8.5,2.5Hz,H-2),6.40(1H,dd,J=8,2Hz,H-8),6.35(1H,d,J=2Hz,H-10),6.33(1H,d,J=2.5Hz,H-4),5.47(1H,d,J=7Hz,H-11a),4.24(1H,d,J=10.5,4.5Hz, H-6α),3.70(3H,s,MeO-9),3.52(2H,m,H-6a,H-6β).13C NMR(100 mHz,CDCI):δ=132.2(C-1),109.8(C-2),156.7(C-3),103.7(C-4),157.0(C-4a),66.6(C-6),39.4(C-6a),119.1(C-6 b),124.8(C-7),106.5(C-8),161.3(C-9),96.9(C-10),160.7(C-10a),78.5(C-11a),112.6(c-11 b),55.5(9-OCH3)。查閱文獻(xiàn)[16]并與文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)對(duì)照，確定3-羥基-9-甲氧基紫檀烷的數(shù)據(jù)與上述文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物(4):白色無(wú)定形粉末;分子式C30H50O;1H NMR(400 MHz,CDCI3):δ=4.66(1H,s,H-29),4.54(1H,s,H-29),3.36(1H,dd,J=11.2,5.2Hz,H-3);13C-NMR(100 mHz,CDCI3):δ=150.9(C-29,t),76.2(C-3,d),50.2(C-5,d),49.0(C-9,d),48.3(C-18,d),48.1(C-19,d),43.1(C-10,s),42.9(C-17,d),41.1(C-14,s),40.1(C-8,s),38.1(C-22,t),37.6(C-13,d),37.3(C-4,s),35.7(C-2,t),34.2(C-16,t),33.3(C-7,t),29.9(C-21,t),28.4(C-23,q),27.5(C-15,t),25.5(C-12,t),25.2(C--11,t),22.2(C-30,q),20.9(C-1,t),19.4(C-28,q),18.3(C-6,t),18.1(C-26,q),16.1(C-24,q),16.0(C-27,q),14.7(C-25,q)。查閱文獻(xiàn)[17]并與文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)對(duì)照，確定3β-羥基-羽扇豆烷的數(shù)據(jù)與上述文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物(5):白色針晶(CHCl3-MeOH);ESI-MS(+)m/z:301.1(M++1).1H NMR(400 mHz, CDCI),δ:7.92(3-OH),7.25(1H,d,J=8Hz,H-1),7.06(1H,s,H-7),6.49(1H,dd,J=8,2Hz,H-2),6.44(1H, m,H-10),6.44(1H,d,J=2Hz,H-4),5.52(1H,d,J=7Hz,H-11a),4.29(1H,dd,J=10.5,4.5Hz,H-6α), 3.90(3H,s,MeO-9),3.77(3H,s,MeO-8),3.65(2H,m,H-6a,H-6β)。查閱文獻(xiàn)[15]并與文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)對(duì)照，確定3-羥基-8,9-二甲氧基紫檀烷的數(shù)據(jù)與上述文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物(6):白色無(wú)定形粉末;1H NMR(400 MHz,CDCI3):δ=5.27(1H,s,H-12),3.15(1H,dd,J=10.4,4.8Hz,H-3),1.03(3H,s,H-28),1.01(3H,s,H-27),0.99(3H,s,H-26),0.94(3H,s,H-30),0.87(3H,s,H-29),0.83(3H,s,H-23),0.79(3H,s,H-25),0.77(3H,s,H-24);13C NMR(100 mHz,CDCI3):δ=143.3(C-13,s), 121.8(C-12,d), 78.2(C-3,d), 54.6(C-5,d), 47.7(C-9,d), 46.4(C-19,t), 46.5(C-17,s), 42.1(C-14,s), 41.2(C-18,d), 40.8(C-8,d), 38.7(C-4,s), 38.1(C-1,t), 38.0(C-10,s), 36.4(C-21,t), 33.3(C-29,q), 32.3(C-7,t), 32.3(C-22,t), 32.1(C-20,s), 30.0(C-23,q), 27.4(C-2,t), 27.1(C-15,t), 26.1(C-27,q), 25.5(C-30,q), 22.8(C-11,t), 22.7(C-16,t), 22.4(C-6,t), 17.8(C-26,q), 16.2(C-25,q), 15.0(C-24,q)。查閱文獻(xiàn)[17]并與文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)對(duì)照，確定3β-羥基-12-烯-齊墩果烷的數(shù)據(jù)與上述文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)基本一致。

2.5 化合物的抗菌作用比較

以番茄灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌和馬鈴薯絲核菌為供試菌對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行活性篩選，結(jié)果表明化合物(2)、化合物(3)和化合物(5)對(duì)供試菌表現(xiàn)相對(duì)較高活性，化合物(2)和化合物(5)對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌活性最高，EC50值分別為10.41 μg/mL和23.52 μg/mL?；衔?3)對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑菌活性最高，其EC50值為31.13 μg/mL，其次為番茄灰霉病菌，EC50值為38.81 μg/mL?；衔?2)和化合物(5)對(duì)黃瓜枯萎病菌也有很高的抑制活性，其EC50值分別為39.17 μg/mL和27.10 μg/mL，化合物(2)對(duì)馬鈴薯絲核菌也有高的抑制活性，其EC50值為21.10 μg/mL。3個(gè)化合物對(duì)番茄早疫病菌和馬鈴薯絲核菌抑制活性較低。

3 討論

黃花棘豆中的主要成分包括甾體、三萜類、黃酮類、生物堿等，其中生物堿類是引起牲畜中毒的主要成分[8]。本文通過(guò)生物活性跟蹤研究，從黃花棘豆乙醇提取物的活性部位中分離得到了6個(gè)化合物,分別為：豆甾-5-烯-3β-醇-7-酮、3-羥基-4,9-二甲氧基紫檀烷、3-羥基-9-甲氧基紫檀烷、3β-羥基-羽扇豆烷、3-羥基-8,9-二甲氧基紫檀烷和3β-羥基-12-烯-齊墩果烷。3-羥基-4,9-二甲氧基紫檀烷具有廣譜性，對(duì)供試菌均表現(xiàn)較高的活性。3-羥基-9-甲氧基紫檀烷和3-羥基-8,9-二甲氧基紫檀烷對(duì)番茄灰霉菌和黃瓜枯萎菌有較高的活性，上述3個(gè)化合物的抑菌活性均顯著高于對(duì)照藥劑，且3個(gè)化合物均屬于紫檀烷類化合物。豆甾-5-烯-3β-醇-7-酮、3β-羥基-羽扇豆烷和3β-羥基-12-烯-齊墩果烷對(duì)供試菌活性很低。紫檀烷類化合物在植物界中主要分布于豆科蝶形花亞科植物中，如香槐屬、鷹嘴豆屬、甘草屬等一些植物中[18]。宋萍[19]等從鬼箭錦雞兒中分離得到3-羥基-4,9-二甲氧基紫檀烷和3-羥基-9-甲氧基紫檀烷，并證明其具有抗真菌和抗細(xì)菌活性。

表4 3種化合物對(duì)4種供試病原菌的毒力測(cè)定及EC50值Table 4 Toxicity test and EC50 of three compounds against four selected pathogenic fungi

在分離得到的6個(gè)化合物中，生物活性測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)紫檀烷類化合物對(duì)供試菌的活性高于豆甾-5-烯-3β-醇-7-酮、3β-羥基-羽扇豆烷和3β-羥基-12-烯-齊墩果烷，其中3-羥基-4,9-二甲氧基紫檀烷對(duì)番茄灰霉菌的EC50值為10.41 μg/mL，其結(jié)果高于武夷菌素對(duì)番茄灰霉菌的抑制作用[20]。

黃花棘豆主要分布在我國(guó)西北、華北和西南地區(qū)的部分天然草場(chǎng)上，自然資源豐富，并且具有較好的抑菌活性和藥理活性，該植物具備開發(fā)為新型植物源殺菌劑的潛力。

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AntifungalactivityandisolationofactiveingredientsinOxytropisochrocephala

Yang Zhenfa1, Yuan Chengshan2, Yang Shunyi1, Liu Lilong1, Yang Jinwei2, Shen Huimin1

(1.PrataculturalCollegeofGansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China;2.StateKeyLaboratoryofAppliedOrganicChemistry,LanzhouUniversity,Lanzhou730000,China)

In order to find new botanical antifungal compounds, antifungal ingredients ofOxytropisochrocephalaBunge were isolated. Using bioassay-guided fractionation methods, antifungal ingredients were isolated and monomeric compounds were identified by modern spectroscopy techniques fromO.ochrocephala. All data were processed statistically by using SPSS 17.0. Ethanol extract ofO.ochrocephalashowed strong activity against the selected pathogenic fungi with an inhibition ratio of 82.08 % at the concentration of 10 mg/mL. The methylene chloride and ethyl acetate phases displayed a significant antifungal activity againstBotrytiscinerea, with an inhibition ratio of 84.30% and 83.13%, respectively. Six compounds were isolated and identified through comparing the data obtained via spectroscopic methods and the values reported in the literature. The screening of antifungal activity showed that 3-hydroxy-4,9-dimethoxypterocarpan,3-hydroxy-9-dimethoxy pterocarpan and 3-hydroxy-8,9-dimethoxypterocarpan had higher EC50on tested fungi. The EC50of 3-hydroxy-4,9-dimethoxypterocarpan againstB.cinereawas 10.42 μg/mL and the EC50of 3-hydroxy-8,9-dimethoxypterocarpan againstFusariumoxysporumwas 27.09 μg/mL.O.ochrocephalacould be used as a biological antifungal agent and pterocarpan compounds are its significant antifungal ingredients.

Oxytropisochrocephala; bioassay-guided method; isolation and identification; active ingredient; pterocarpan

2013-12-21

：2014-03-19

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項(xiàng)目(GNSW-2004-08)；甘肅省教育廳基金項(xiàng)目(032-06)

S 482.292

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.011

* 通信作者 E-mail:yangshy@gsau.edu.cn