林孟波，王金泗，薛芳沁，黃若磊，李偉華

論著·基礎(chǔ)

miR-126在人結(jié)腸癌細胞中的表達及其對結(jié)腸癌 細胞生物學(xué)行為的影響

林孟波，王金泗，薛芳沁，黃若磊，李偉華

目的探討MicroRNA-126(miR-126)在人結(jié)腸癌細胞中的表達以及對結(jié)腸癌細胞生物學(xué)行為的影響。方法應(yīng)用熒光PCR定量檢測60例結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌組織以及癌旁組織中miR-126的表達，共60對，再測定5株結(jié)腸癌細胞(SW480、HT29、HCT116、LOVO、SW620)中的表達情況;CCK-8法、劃痕實驗和Transwell實驗檢測細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并進一步通過體外實驗研究miR-126對結(jié)腸癌細胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果與癌旁組織細胞比較，miR-126在結(jié)腸癌細胞中表達下降(95.0% vs.55.0%，P<0.05)，發(fā)生轉(zhuǎn)移者與未發(fā)生轉(zhuǎn)移者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(25.0% vs. 75.0%，P<0.05)。miR-126可以抑制SW480細胞的生長及其侵襲轉(zhuǎn)移，有基質(zhì)膠Transwell實驗中，轉(zhuǎn)染組及空白對照組細胞遷移數(shù)分別為(10.0±4.3)個和(258.0±30.6)個；無基質(zhì)膠的Transwell實驗中，分別為(84.0±13.2)個和(335.0±27.3)個，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。miR-126高表達可以增強癌細胞對奧沙利鉑的敏感性。結(jié)論miR-126可明顯抑制結(jié)腸癌細胞的發(fā)生發(fā)展，影響多種結(jié)腸癌細胞株生物學(xué)行為。

miR-126；結(jié)腸癌細胞；生物學(xué)行為；影響

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，好發(fā)于直腸乙狀結(jié)腸交界處，近年來發(fā)病率逐年上升，2012年《腫瘤登記年報》排名第3位，發(fā)病率為29.44/萬，病死率排第5位，為14.23/萬。結(jié)腸癌組織學(xué)主要為腺癌、黏液腺癌和未分化癌，危害極大[1]。最近的研究表明miR-126在肺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達均下降，但其在結(jié)腸癌中表達是否下降仍然不很清楚，其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制也不甚了解?，F(xiàn)通過基因表達芯片技術(shù)了解miR-126在結(jié)腸癌組織、癌旁組織和5株人結(jié)腸癌細胞系中的表達及變化，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2013年1—9月我院腫瘤科確診為結(jié)腸癌手術(shù)患者的腫瘤組織和癌旁組織(癌旁0.5 cm和癌旁15 cm)，共60例，患者在手術(shù)前均未進行放、化療。男40例，女20例，年齡35～65(50.0±1.6)歲。組織學(xué)類型：高分化13例，中分化17例，低分化30例。Dukes分期：A期4例，B期23例，C期20例，D期13例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。有遠處轉(zhuǎn)移13例，無遠處轉(zhuǎn)移47例，所有組織于離體15 min內(nèi)置于液氮罐中保存。

1.2 細胞系、載體及試劑 5株人結(jié)腸癌細胞系SW480、HT29、HCT116、LOVO 和 SW620 均購買于行知生物科技有限公司，HEK293T細胞株購自美國ATCC(美國模式菌種收集中心)。慢病毒表達載體pGIPZ、慢病毒包裝質(zhì)粒pCD/NL-BHDDD、膜蛋白表達質(zhì)粒pLTRG均購自深圳市寶珠生物科技有限公司。Lipofectamine2000購自上海葉舟生物科技有限公司，快速限制性內(nèi)切酶CLaI、MLuI、T4DNA連接酶均購自美國Fermentas公司,CCK-8試劑盒、DMEM培養(yǎng)液、地高辛標記hsa-miR-126寡核苷酸探針購自丹麥Exiqon公司。胎牛血清購自上海拜力生物科技有限公司，總RNA的提取液，IRS-l兔單克隆抗體購自Epitomics公司。

1.3 研究方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)：將5種結(jié)腸癌細胞株(SW480、HT29、HCT116、LOVO、SW620)，在含有100 ml/L胎牛血清的1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)液中(37℃ 5% CO2飽和濕度)常規(guī)培養(yǎng)，這些細胞株代表的組織各異，分別用來檢測miR-126在各自細胞株的表達，在細胞生長狀態(tài)良好時(取對數(shù)生長期)用于實驗[3]。SW480主要用于測定細胞的侵襲轉(zhuǎn)移對細胞生長的影響；SW620用于細胞轉(zhuǎn)染。分別測定miR-126在各個細胞的表達。

1.3.2 RT-PCR檢測miR-126在結(jié)腸癌組織及癌旁細胞中的表達：利用總RNA的提取液，嚴格按照提取液操作說明書提取結(jié)腸癌組織和癌旁細胞中總RNA ，CDNA的制備按照All-in-one miRNA qRT-PCR Detection kits，反應(yīng)體系如下：RNA 2 μg，poly A polymerase(2.5 U/μl,1 μl) ,RTase Mix 1 μl,5×Reaction Buffer 5 μl,加H2O至終體積25 ml。反應(yīng)條件:37.5℃ 90 min,80℃ 5 min,25℃保存。實施定量的反應(yīng)體系同樣用All-in-one miRNA qRT-PCR Detection kits說明書進行，反應(yīng)條件：預(yù)期變性90℃ 10 min，90℃ 10 s,退火60℃ 30 s。

1.3.3 miR-126慢病毒表達載體構(gòu)建：利用Primes軟件設(shè)計引物，同時引入CLaI、MLuI酶切位點及引物的序列及末端的保護堿基，根據(jù)生物信息技術(shù)從數(shù)據(jù)庫可以查出基因序列為引物序列：5`-CGACGCGTCGGGTTTACAGAACACCCATCA-3`，Reverse:5`-CCATGGGGCACAGCAACAAAAGACT-3`，擴增的片段長度為357 bp,以正常黏膜組織DNA為模,PCR擴增miR-126，在一定的反應(yīng)條件下，循環(huán)擴增。將擴增的產(chǎn)物利用瓊脂漿電泳液電泳，如果發(fā)現(xiàn)無雜帶就直接對PCR產(chǎn)物純化回收。經(jīng)CLaI、MLuI酶切PCR產(chǎn)物，連接到pGIPZ載體上，再經(jīng)過轉(zhuǎn)化、挑選單克隆、菌液PCR鑒定陽性菌落制備小量的質(zhì)粒，通過酶切，測序后得到正確的重組質(zhì)粒pGIPZ-miR-126。

1.3.4 結(jié)腸癌細胞的復(fù)制能力：按照CCK-8試劑盒說明進行。將細胞按每孔2×103/150 μl接種于100孔板中繼續(xù)培養(yǎng),每組設(shè)3個復(fù)孔,分別選取1、3、5、7 d時間點進行檢測,檢測前換液1次,每孔加100 μl新鮮培養(yǎng)基和10 μ1 CCK-8,繼續(xù)在37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)2 h,使用酶標儀于550 nm波長檢測光密度值。

1.3.5 劃痕實驗：細胞鋪入8孔板,放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，等到細胞融合達85%以上時,用15 μl微量移液頭在8孔板內(nèi)水平劃痕,PBS液洗滌3次，每隔24 h在倒置顯微鏡下觀察細胞的遷移情況并拍照[4]。

1.3.6 細胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前1天，將對數(shù)生長期的HCT116細胞接種于8孔培養(yǎng)板。每孔2×105個細胞。24 h培養(yǎng)至細胞融合度 60%時，分為pGIPZ-miR-126轉(zhuǎn)染組、空白對照組(pGIPZ)。按照Lipofectamine2000說明書，將2組病毒上清分別感染SW480細胞，感染后72 h熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的發(fā)光情況，成功轉(zhuǎn)染細胞后置于37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[5]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。組織標本采用配對樣本t檢驗比較miR-126水平差異,熒光定量PCR采用單因素方差分析，體外增殖實驗采用析因設(shè)計的方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-126在結(jié)腸癌組織中表達 應(yīng)用Real-timePCR檢測60對配對的結(jié)腸癌組織中miR-126的表達，結(jié)果顯示，癌旁組織中miR-126陽性率為95.0%，明顯高于結(jié)腸癌組織的55.0%(P<0.01)。見表1。進一步分析miR-126與結(jié)腸癌臨床特點的關(guān)系表明，miR-126表達與性別、年齡、癌組織分化程度以及腫塊大小均無明顯的相關(guān)性(P>0.05),而無轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌細胞中miR-126的陽性表達率為75.0%，高于已發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移者的25.0%(P<0.05)。見表2。

表1 結(jié)腸癌組織和癌旁組織中miR-126的表達 [n(%)]

注：與癌旁組織比較,*P<0.01

表2 miR-126表達與結(jié)腸癌臨床特點相關(guān)性分析

2.2 miR-126表達對結(jié)腸癌細胞生物學(xué)行為影響

2.2.1 miR-126表達可抑制SW480細胞生長：利用MTT比色法檢測轉(zhuǎn)染組和空白對照組SW480細胞的增殖能力，結(jié)果顯示隨培養(yǎng)時間的延長，轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力明顯低于空白對照組，提示miR-126具有抑制結(jié)腸癌細胞增殖的能力。進一步對2組細胞周期進行檢測發(fā)現(xiàn)，miR-126主要阻滯腸癌細胞G1期進程。

2.2.2 miR-126抑制SW480細胞侵襲轉(zhuǎn)移：利用有基質(zhì)膠及無基質(zhì)膠Transwell實驗檢測miR-126對細胞遷移、侵襲能力的作用，經(jīng)過一段時間的觀察，結(jié)果表明，有基質(zhì)膠的細胞培養(yǎng)36 h后，轉(zhuǎn)染組及空白對照組細胞遷移數(shù)分別為(10.0±4.3)個和(258.0±30.6)個;無基質(zhì)膠的細胞在培養(yǎng)36 h后計數(shù),轉(zhuǎn)染組和空白對照組分別為(84.0±13.2)個、(335.0±27.3)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2.3 miR-126的表達對結(jié)腸癌細胞耐藥性的影響：使用奧沙利鉑(抗癌類藥物)處理細胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組SW480細胞對奧沙利鉑的敏感性明顯高于空白對照組(P<0.05)。說明結(jié)腸癌細胞中恢復(fù)miR-126的表達可提高癌細胞對化療類藥物的敏感性。通過增加miR-126可以加強化療類藥物的藥效，進一步可以加強對結(jié)腸癌的治療。

3 討 論

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，結(jié)腸癌發(fā)病與高脂肪食物和纖維素攝入不足有關(guān)。結(jié)腸的慢性炎性反應(yīng)使腸癌的發(fā)生率比一般人群高。有結(jié)腸息肉者結(jié)腸癌發(fā)病率是無結(jié)腸息肉者的5倍[5]。家族性多發(fā)性腸息肉病，癌變的發(fā)生率更高。遺傳因素可能也參與結(jié)腸癌的發(fā)生。其發(fā)病率和病死率在世界大多數(shù)國家及地區(qū)有上升趨勢，給人類的健康帶來嚴重的危害，發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移為其主要死因。MicroRNA(miRNA)是近年新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小分子單鏈RNA，長度為21～23個核苷酸。在細胞分化、增殖、凋亡及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等方面具有重要的生物學(xué)功能。miR-126參與調(diào)節(jié)血管生成和維持血管完整性。

miR-126在肺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達都會下降，在結(jié)腸癌細胞株中特別是高侵襲轉(zhuǎn)移能力的細胞系中表達下調(diào)，尤其是發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的癌組織中表達降低，高度提示miR-126在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[6]。Guo等[7]研究表明miR-126在結(jié)腸癌細胞中普遍缺失。本研究表明在結(jié)腸癌組織存在miR-126表達下降，并且miR-126表達水平的變化與結(jié)腸癌是否發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，與文獻報道相近。體外實驗還證實miR-126可通過抑制結(jié)腸癌細胞周期(主要為G1期)進程、促進結(jié)腸癌細胞凋亡而發(fā)揮抑瘤作用，并可顯著抑制結(jié)腸癌細胞遷移及侵襲能力[8]。但是對于miR-126表達方式以及miR-126對結(jié)腸癌細胞作用的具體分子機制現(xiàn)在還不甚了解，有待于進一步研究。

本研究表明高表達miR-126的細胞株對轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌一線化療藥物奧沙利鉑的敏感性明顯高于空白對照組，可見在結(jié)腸癌細胞中恢復(fù)miR-126的表達可抑制結(jié)腸癌細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移并減少耐藥性的發(fā)生，同時也表明增加miR-126的表達可以進一步增加化療藥物的療效。與前期的研究報道相符?；熯^程中可以按照周期進行，同時應(yīng)用使miR-126恢復(fù)的藥物治療方法可以使治療效果更好。

加強對結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的預(yù)防，慢性結(jié)腸炎患者、結(jié)腸息肉患者、男性肥胖者等為易感人群。每年要定期在結(jié)腸癌高危人群中進行篩檢，通過檢測miR-126表達的變化防止癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移[9～11]。最好能早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，降低疾病的病死率。對已經(jīng)確診的結(jié)腸癌患者最好檢測miR-126表達的變化，指導(dǎo)預(yù)后判斷，miR-126表達水平越低患者預(yù)后越差。

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miR-126expressionanditseffectonhumancoloncancercellsinthebiologicalbehaviorofcoloncancercells

LINMengbo,WAGNJinsi,XUEFangqin,HUANGRuolei,LIWeihua.

DepartmentofOncology,FujianProvincialHospital,Fuzhou350001,China

ObjectiveTo investigate the expression of MicroRNA -126 (miR-126) in human colon cancer cellSand itSeffect on biological behavior of colon cancer cells.MethodsSixty patientSwith colon cancer were enrolled in the study. Fluorescence PCR waSused to detect the expression of miR-126 in the cancerouStissueSand in the tissueSadjacent to carcinoma. The expression of miR-126 in the cancerouStissueSpaired up with the expression of miR-126 in the tissueSadjacent to carcinoma,and there were 60 pairSin total. The expression of miR-126 in 5 colon cancer cell lineS(SW480,HT29,HCT116,LOVO,SW620) waSalso detected. The proliferation,migration and invasion ability of the cellSwere measured using CCK 8 assay,scratch experimentSand Transwell assay,respectively. The effect of miR-126 on the biological behaviorSof human colon cancer cellSwaSfurther studied through the experimentSin vitro.ResultsCompared with adjacent normal tissue cells,miR-126 waSdecreased (95.0% vs. 55.0%,P<0.05) in colon cancer cells,and were obviously when cancer metastasiSor invasion iSparticularly evident,when compared with those without metasis,there were significant difference(25.0% vs.75.0%,P<0.05). StudieShave shown that miR-126 can inhibit the growth of SW480 cellSand their invasion and metastasis,Transwell assay with matrigel showed the migration cell number in transfection group and blank control group waS(10.0±4.3) and (258.0±30.6),while Transwell assay without matrigel showed the migration cell number waS(84.0±13.2) and (335.0±27.3) respectively,there were significant differences(P<0.05). miR-126 expression can enhance the sensitivity of cancer cellSto oxaliplatin.ConclusionmiR-126 can inhibit the development of colon cancer cells,the impact of a variety of strainSof the biological behavior of colon cancer cells.

Micro RNA-126;Colon cancer cells; Biological behavior; Impact

350001 福州，福建省立醫(yī)院腫瘤外科

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.04.021

2013-11-15)