黃敏等

摘 要 從NCBI的dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)中下載假臭草同族植物的EST序列，經(jīng)EST序列處理及SSR位點(diǎn)查詢，首次設(shè)計(jì)了27對(duì)假臭草EST-SSRs引物，以海南省文昌市假臭草DNA為模板，采用單因素和L16（45）正交試驗(yàn)對(duì)其EST-SSRs PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。建立了假臭草EST-SSRs最佳20 μLPCR反應(yīng)體系：Mg2+濃度為2.75 mmol/L，模板DNA用量為35 ng，Tag DNA聚合酶為2.25 U，dNTPs濃度為0.3 mmol/L，引物濃度為0.6 μmmol/L。并用14個(gè)不同來(lái)源的假臭草樣本對(duì)其體系進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均能獲得穩(wěn)定的、清晰明亮的擴(kuò)增譜帶。假臭草EST-SSRs 標(biāo)記的開(kāi)發(fā)為深入研究其遺傳多樣性提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 假臭草 ；EST-SSRs ；引物設(shè)計(jì) ；優(yōu)化

分類號(hào) Q754 ；S451

Abstract In this study， we download ESTs form dbEST database and first designed 27 primer pairs for Praxelis clematidea after EST pretreatment and SSR locus identification. The sample were collected from Wenchang City in Hainan province as DNA template， and the optimization and establishment of EST-derived SSR-PCR reaction system for Praxelis clematidea was carried out by single factor test and orthogonal experiment design of L16（45）. The result was indicated that the optimal EST-SSRs PCR reaction system （20 μL） was contained 2.75 mmol/L Mg2+， 35 ng DNA template， 2.25 U Tag DNA polymerase， 0.3 mmol/L dNTPs and 0.6 μmol/L primer. This system was tested by 14 Praxelis clematidea from different places， which stable and clear polymorphic bands were acquired. Accordingly， the development of EST-SSRs can be used for the genetic diversity research of Praxelis clematidea.

Keywords Praxelis clematidea ； EST-SSRs ； primer design ； optimization

假臭草（Praxelis clematidea R. M. King & H. Robinson）是菊科（Composite）假臭草屬（Praxelis）植物[1]，原產(chǎn)南美洲，傳入中國(guó)后曾一直被誤認(rèn)為藿香薊（Ageratum conyzoides linn.）或熊耳草（Ageratum houstonianum Miller）[2-3]。假臭草適應(yīng)性強(qiáng)，對(duì)土壤養(yǎng)分有較強(qiáng)的吸收力，種子具冠毛，易于傳播和對(duì)其它植物受體有化感作用，對(duì)中國(guó)華南入侵生境破壞嚴(yán)重[4-5]。假臭草EST-SSRs分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，為其遺傳多樣性研究及其近緣種的鑒定提供了基礎(chǔ)。

EST（Expressed sequence tags）是通過(guò)對(duì)由mRNA逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA克隆測(cè)序得到的一部分序列，代表著一定條件下基因組的部分轉(zhuǎn)錄信息[6]，是一段完整的或部分的基因表達(dá)序列，相比SSR而言，EST-SSRs在近緣種間具有更高的通用性和保守性[7]。EST-SSRs分子標(biāo)記是基于PCR的標(biāo)記手段，PCR結(jié)果受到Tag聚合酶﹑Mg2+濃度、DNA模板濃度、dNTPs濃度及引物濃度的相互影響，因此，ESR-SSRs標(biāo)記的開(kāi)發(fā)必須建立穩(wěn)定可靠的PCR反應(yīng)體系。假臭草EST-SSRs標(biāo)記的開(kāi)發(fā)未見(jiàn)報(bào)道，本研究的主要目的為：（1）利用EST-SSRs的可通用性特征[7-8]，以假臭草近緣種的EST序列設(shè)計(jì)EST-SSRs引物；（2）采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)PCR反應(yīng)體系中五因素（Tag DNA聚合酶、Mg2+濃度、DNA模板、dNTPs及引物濃度）設(shè)置不同的水平梯度，篩選出最適濃度范圍；（3）基于單因素結(jié)果，設(shè)計(jì)L16（45）正交試驗(yàn)，建立假臭草EST-SSRs標(biāo)記的最佳PCR反應(yīng)體系。

1 材料和方法

1.1 材料

假臭草樣品來(lái)源于海南省和廣東省不同市縣，見(jiàn)表1。采摘新鮮葉片，硅膠封裝，轉(zhuǎn)至-20℃冰箱保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 假臭草基因組DNA的提取與檢測(cè)

采用改良的CTAB法提取假臭草基因組DNA[9]。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，ND-2000超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)出基因組DNA母液濃度（ng/μL）和純度（A260/A280），并將母液用滅菌ddH2O稀釋為10 ng/μL的工作液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 EST-SSRs標(biāo)記引物的設(shè)計(jì)和篩選

目前為止，NCBI（National Center for Biotechnology Information）的dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有公布假臭草EST序列，根據(jù)EST-SSRs標(biāo)記的可通用性特征，分別下載了假臭草同族植物勝紅薊（A. conyzoides）、薇甘菊（Mikania micrantha）和甜葉菊（Stevia rebaudiana）的EST序列設(shè)計(jì)引物（截止2013年6月）。對(duì)下載的EST序列進(jìn)行預(yù)處理：保留長(zhǎng)度100～700 bp（5′～3′）的EST序列，用DNA Star軟件去除序列中的載體、重復(fù)和PolyA/T序列[10-11]，獲得最低冗余度的EST序列。SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool）軟件查找EST中的SSR位點(diǎn)（http：//www.gramene.org /gramene/search es/ssrtool），SSR位點(diǎn)篩選的標(biāo)準(zhǔn)為：含二﹑三﹑四﹑五﹑六核苷酸基元的最小重復(fù)數(shù)依次為8﹑6﹑5﹑4和3次。用Primer Premer 5.0軟件設(shè)計(jì)EST-SSRs引物，引物設(shè)計(jì)的主要參數(shù)為：（1）退火溫度為50～60℃；（2）引物長(zhǎng)度為18～24 bp，20 bp最佳；（3）PCR產(chǎn)物長(zhǎng)在100～500 bp；（4）GC%含量為40%～60%[12]。首次設(shè)計(jì)了27對(duì)EST-SSRs引物（表2），送往上海生工生物工程有限公司合成。以擴(kuò)增譜帶清晰明亮、具有多態(tài)性為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)27對(duì)引物進(jìn)行篩選，篩選的反應(yīng)體系為：20 μL PCR反應(yīng)體系中，Mg2+濃度為2.5 mmol/L，模板DNA用量為20 ng，Tag DNA聚合酶為1.5 U，dNTPs濃度為0.25 mmol/L，引物濃度為0.6 μmol/L，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃。預(yù)變性5 min，然后按94℃變性50 s，53℃退火40 S，72℃延伸70 S，40次循環(huán)；72℃延伸5 min[13]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選得出最優(yōu)的引物作為PCR反應(yīng)體系的引物。endprint

1.2.3 EST-SSRs標(biāo)記PCR反應(yīng)的單因素試驗(yàn)

分別對(duì)模板Mg2+、dNTPs、引物、Tag酶及DNA模板進(jìn)行梯度試驗(yàn)，篩選最佳適宜濃度范圍。Mg2+濃度試驗(yàn)中設(shè)0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00 mmol/L 10個(gè)梯度；dNTPs濃度試驗(yàn)中設(shè)0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mmol/L 8個(gè)梯度；引物濃度設(shè)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 μmol/L 8個(gè)梯度；Tag酶濃度設(shè)0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00 U/20μL 11個(gè)梯度；DNA模板量設(shè)10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、80、100 ng/20μL 12個(gè)梯度。PCR反應(yīng)程序同1.2.2。

1.2.4 EST-SSRs標(biāo)記PCR反應(yīng)因素水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于1.2.3篩選出的EST-SSRs標(biāo)記PCR反應(yīng)體系中模板DNA、Tag酶、Mg2+、引物及dNTPs濃度五因素的適宜濃度范圍，運(yùn)用正交輔助軟件構(gòu)建L16（45）正交試驗(yàn)表，設(shè)計(jì)模板DNA、Mg2+、引物、dNTPs及Tag酶五因素和不同濃度的4水平正交試驗(yàn)（表3）。根據(jù)表3，制備總體積為20 μL的PCR反應(yīng)體系，除了表中的五因素外，加入2.0 μL 10×PCR buffer，不足20 μL用滅菌dd H2O補(bǔ)足，PCR反應(yīng)程序同1.2.2。

1.2.5 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染

對(duì)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，DL2000為Marker，220 V電壓下電泳2 h。電泳完后，用蒸餾水清洗凝膠2次，放入500 mL的0.1%硝酸銀染色液中浸泡10 min，取出凝膠并再次用蒸餾水清洗2次，放入500 mL的顯影液中顯影。銀染結(jié)果用數(shù)碼相機(jī)拍照保存。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)擴(kuò)增條帶的敏感性與特異性即條帶強(qiáng)弱及雜帶的多少作1～16分記分，分?jǐn)?shù)越高，表示敏感性、特異性越好[14]。3次重復(fù)獨(dú)立打分，根據(jù)得分計(jì)算各因素同一水平的試驗(yàn)值之和（Ki）和該水平下的數(shù)據(jù)平均值（ki），并計(jì)算同一因素不同水平間的極差R。每一因素水平下的數(shù)據(jù)平均值ki反映了因素各水平間對(duì)PCR反應(yīng)體系的影響情況，PCR反應(yīng)體系優(yōu)化時(shí)，應(yīng)選取ki最大值對(duì)應(yīng)的最適濃度水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTAB法提取假臭草基因組DNA

從瓊脂糖凝膠電泳圖（圖1）可以看出，提取的假臭草基因組DNA的電泳條帶單一，清晰明亮，點(diǎn)樣孔無(wú)滯留，ND-2000超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果顯示DNA的A260/A230比值為1.8～1.9，A260/A230比值為2.2～2.4，滿足EST-SSRs標(biāo)記需求。

2.2 引物篩選

依據(jù)擴(kuò)增條帶的敏感性、特異性和數(shù)量，篩選出srSSR716作為PCR反應(yīng)體系的最佳引物。

2.3 EST-SSRs標(biāo)記PCR反應(yīng)體系的單因素試驗(yàn)分析

2.3.1 Mg2+濃度對(duì)EST-SSRs標(biāo)記的PCR擴(kuò)增影響

Mg2+不同水平梯度試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2-A），當(dāng)Mg2+濃度為0.75～2.25 mmol/L時(shí)，有2條擴(kuò)增譜帶，條帶清晰但卻有一定的彌散和拖尾現(xiàn)象；當(dāng)Mg2+濃度為2.25～3.00 mmol/L時(shí)，有3條擴(kuò)增普帶，條帶清晰明亮，彌散和拖尾現(xiàn)象不明顯，因此，假臭草EST-SSRs PCR反應(yīng) 體系中Mg2+濃度的適宜濃度范圍為2.25～3.00 mmol/L。

2.3.2 dNTPs濃度對(duì)EST-SSRs標(biāo)記的PCR擴(kuò)增影響

dNTPs參與新鏈DNA的合成，直接影響PCR的產(chǎn)量。由圖2-B所示，當(dāng)dNTPs濃度為0.05 mmol/L時(shí)，PCR產(chǎn)物產(chǎn)量少，擴(kuò)增譜帶不清晰，DNA條帶較弱；當(dāng)dNTPs濃度為0.05～0.20 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增譜帶的清晰度與濃度的大小呈正相關(guān)性；當(dāng)dNTPs濃度為0.25～0.40 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增譜帶清晰完整，但隨著dNTPs濃度的增大，DNA條帶并沒(méi)有顯著的變化。因此，假臭草EST-SSRs PCR反應(yīng)體系中dNTPs濃度的適宜濃度范圍為0.25～0.40 mmol/L。

2.3.3 引物濃度對(duì)EST-SSRs標(biāo)記的PCR擴(kuò)增影響

由圖2-C可以看出，PCR的產(chǎn)量與引物濃度呈正相關(guān)性，當(dāng)引物濃度為0.1～0.2 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增譜帶較弱，不清晰；當(dāng)引物濃度為0.3～0.4 μmol/L時(shí)，隨著濃度的增加，擴(kuò)增譜帶變得清晰明亮；當(dāng)引物濃度為0.5～0.7 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增譜帶清晰明亮，但并沒(méi)有隨著濃度的增加而呈現(xiàn)出明顯的變化；當(dāng)引物濃度為0.8 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增譜帶開(kāi)始出現(xiàn)彌散現(xiàn)象。因此，假臭草EST-SSRs PCR反應(yīng)體系中引物濃度的適宜濃度范圍為0.4～0.8 μmol/L。

2.3.4 Tag DNA聚合酶用量對(duì)EST-SSRs標(biāo)記的PCR擴(kuò)增影響

Tag酶的用量影響PCR擴(kuò)增的效率。由圖2-D 可見(jiàn)，Tag酶用量過(guò)低時(shí)，PCR擴(kuò)增效率低下，當(dāng)Tag酶用量為0.50～2.00 U時(shí)，有擴(kuò)增譜帶出現(xiàn)，但同一Tag酶用量下，DNA條帶間清晰不一；當(dāng)Tag酶用量為2.25～3.00 U時(shí)，擴(kuò)增譜帶清晰度隨Tag酶用量的增加而增大。因此，假臭草EST-SSRs PCR反應(yīng)體系中Tag DNA聚合酶用量的適宜濃度范圍為2.25～3.00 U。

2.3.5 模板DNA量對(duì)EST-SSRs標(biāo)記的PCR擴(kuò)增影響endprint

模板DNA的質(zhì)量和用量影響PCR結(jié)果的敏感性和擴(kuò)增效率。由圖2-E所示，當(dāng)模板DNA用量為10、15、20 ng/20μL 時(shí)，擴(kuò)增譜帶有缺失的現(xiàn)象，相比其他用量而言，DNA條帶較弱；當(dāng)模板DNA用量為40、45、50、60、80、100 ng/20μL時(shí)，隨著模板DNA用量的增加，PCR結(jié)果的敏感性降低，出現(xiàn)非特異性DNA條帶，且存在彌散現(xiàn)象；當(dāng)模板DNA用量為25、30、35 ng/20 μL 時(shí)，擴(kuò)增譜帶清晰明亮。因此，假臭草EST-SSRs PCR反應(yīng)體系中模板DNA量的適宜濃度范圍為25～35 ng/20 μL。

2.4 EST-SSRs標(biāo)記PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，EST-SSRs標(biāo)記PCR反應(yīng)體系中5個(gè)因素的最佳反應(yīng)水平為A4B3C3D1E2（表4），并不在正交組合表中出現(xiàn)，但與組合9和組合15接近。

2.5 PCR最佳反應(yīng)體系的穩(wěn)定性驗(yàn)證

根據(jù)正交設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)分析及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果（圖3），結(jié)合經(jīng)濟(jì)原則，選擇組合15為最優(yōu)反應(yīng)體系，對(duì)海南和廣東地區(qū)的14個(gè)假臭草樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果（圖4）顯示，擴(kuò)增譜帶清晰明亮，穩(wěn)定性好，具有多態(tài)性。

3 討論與結(jié)論

3.1 EST-SSRs引物的設(shè)計(jì)

引物的設(shè)計(jì)是一個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題：涉及目的條帶的長(zhǎng)度大小（如大片段的cDNA，小片段的點(diǎn)突變基因及其側(cè)翼序列）；模板DNA的復(fù)雜程度[11]；引物設(shè)計(jì)的軟件（Premier Primer、Oligo、Dnastar、Primer-BLAST等）[16]；以及主要參數(shù)的差異（引物長(zhǎng)度、Tm值、GC%含量、預(yù)產(chǎn)物長(zhǎng)度），都會(huì)導(dǎo)致引物設(shè)計(jì)結(jié)果的變化。

3.2 假臭草EST-SSRs標(biāo)記PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

單因素設(shè)計(jì)僅對(duì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，不能檢測(cè)PCR反應(yīng)體系中各因素間的交互作用，可能會(huì)導(dǎo)致亞優(yōu)化結(jié)果的產(chǎn)生[17]，而正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)可以彌補(bǔ)這一缺點(diǎn)，可以了解各因素間的內(nèi)在規(guī)律，找到最佳的水平組合。另外，EST序列中缺乏內(nèi)含子序列，EST-SSRs標(biāo)記的對(duì)象是基因組DNA，因此，基因組DNA中未識(shí)別的內(nèi)含子剪接位點(diǎn)會(huì)干擾引物與模板的結(jié)合，導(dǎo)致擴(kuò)增失敗，引物結(jié)合位點(diǎn)之間的內(nèi)含子會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物過(guò)長(zhǎng)，或者擴(kuò)增失敗[8]，如圖4中顯示，HWC的擴(kuò)增產(chǎn)物過(guò)長(zhǎng)。在類群間，內(nèi)含子位點(diǎn)是相對(duì)保守的，同時(shí)可以通過(guò)與模式植物，如擬南芥或水稻的基因組序列校準(zhǔn)提高引物的效率。

本實(shí)驗(yàn)中Mg2+濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量具有顯著影響，PCR反應(yīng)體系中的Tag DNA聚合酶需要 Mg2+來(lái)激活，適量的Mg2+濃度可以提高Tag酶的活性，濃度過(guò)高則抑制Tag酶的活性，過(guò)低則無(wú)法徹底激活Tag酶的活性[18]。dNTPs作為PCR反應(yīng)的原料，其濃度的大小直接影響PCR的產(chǎn)量，濃度過(guò)低，擴(kuò)增譜帶較弱甚至無(wú)帶，過(guò)高則與Tag酶發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，爭(zhēng)奪Mg2+，抑制PCR反應(yīng)[19]。從單因素試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，引物濃度超過(guò)一定值后，隨著濃度的增加，PCR結(jié)果并沒(méi)有明顯的變化，相對(duì)于PCR反應(yīng)體系中其他4個(gè)因素而言，引物的優(yōu)化應(yīng)偏向于經(jīng)濟(jì)角度考慮[20]。Tag酶的用量直接影響PCR的擴(kuò)增效率，酶量過(guò)多，不僅增加實(shí)驗(yàn)成本，同時(shí)也會(huì)提高錯(cuò)配率，引起非特異性擴(kuò)增，用量過(guò)低則導(dǎo)致酶與引物無(wú)法完美的結(jié)合。模板DNA的質(zhì)量和用量影響PCR的敏感性和擴(kuò)增效率，圖2-E所示，模板DNA用量不同，其擴(kuò)增結(jié)果有顯著差異，用量過(guò)多時(shí)，擴(kuò)增譜帶出現(xiàn)彌散和變?nèi)醯默F(xiàn)象。正交直觀分析結(jié)果顯示的最佳PCR反應(yīng)體系并不在正交組合中，但與組合9和組合15接近，然而與組合15相比，組合9中對(duì)Tag酶和引物的需求量較多，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，節(jié)約成本，最終選擇組合15為假臭草EST-SSRs標(biāo)記的PCR最優(yōu)反應(yīng)體系，即在20 μL的反應(yīng)體系中，Mg2+濃度為2.75 mmol/L，模板DNA用量為35 ng，Tag DNA聚合酶為2.25 U，dNTPs 濃度為0.3 mmol/L，引物濃度為0.6 μmol/L。與甘蔗[21]、茄子[22]以及薔薇科植物[23]相比，假臭草EST-SSRs PCR最優(yōu)反應(yīng)體系中的Tag酶用量偏高，這可能是由于研究對(duì)象以及樣品處理方式的差異所導(dǎo)致的。

3.3 EST-SSRs標(biāo)記的可通用性研究

目前，關(guān)于EST-SSRs標(biāo)記的可通用性研究已取得了一定的成果。Malay等[24]研究發(fā)現(xiàn)，葦狀羊茅（Festuca arundinacea Schreb.）的EST-SSRs引物在11種禾本科植物間產(chǎn)生清晰的擴(kuò)增譜帶，可用于羊茅屬和黑麥草屬的遺傳研究。 Gasic等[23]研究蘋果EST-SSRs引物在50種薔薇科植物間的通用性，其通用能力為25%（杏子）～59%（梨），其中11對(duì)引物可進(jìn)一步用于薔薇科植物間的通用性研究。小麥[25]、茄子[22]等也有EST-SSRs通用性研究的相關(guān)報(bào)道。本研究開(kāi)發(fā)的EST-SSRs標(biāo)記在14個(gè)假臭草樣本的穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果同樣表明，使用勝紅薊、薇甘菊和甜葉菊EST序列建立起來(lái)的EST-SSRs標(biāo)記也可用于研究近緣種假臭草的遺傳多樣性。

致 謝 感謝國(guó)家標(biāo)本平臺(tái)教學(xué)標(biāo)本子平臺(tái)資助（http：//mnh.scu.edu.cn/）。

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