蘇 洋，陳智華，鄧海平，李春慧，蒲萬霞*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

耐甲氧西林金黃色葡萄球(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)是醫(yī)院內(nèi)和社區(qū)內(nèi)獲得性感染的主要病原菌，也引起動物疾病的發(fā)生，而且健康人群的攜帶率為20 %～30 %[1]，其攜帶的mecA 耐藥基因編碼與β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力極低的PBP2a 蛋白而導(dǎo)致菌株的耐藥。自1940 年青霉素被用于治療因金黃色葡萄球菌(S.aureus)引起的感染后，很快便出現(xiàn)了耐藥菌株；1959年，半合成青霉素-甲氧西林首次被用于治療耐青霉素的S.aureus 后，1961 年既有MRSA 的報(bào)道。在隨后的幾十年中其耐藥菌株在世界范圍內(nèi)不斷地出現(xiàn)，由于其高度耐藥性和異質(zhì)性給臨床治療帶來了極大的困難。美國每年因感染MRSA 而導(dǎo)致的死亡人數(shù)已超過艾滋病，我國MRSA的感染率達(dá)到了33.3 %～80.4 %。MRSA 的感染已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)，許多學(xué)者將MRSA 的感染同艾滋、乙型肝炎列為世界范圍內(nèi)最難解決的3 大感染性疾病。近年來，越來越多不同動物源性MRSA 的出現(xiàn)，給獸醫(yī)臨床和公共衛(wèi)生安全帶來極大的威脅。本文就近年來國內(nèi)外對MRSA 的分型方法及其在動物種的流行情況作一綜述。

1 分型方法

1.1 脈沖場凝膠電泳分型方法(PFGE)PFGE 是上世紀(jì)80 年代Schwartz 和Cantor 等建立的，可以用來分離整條染色體這樣超大分子量的細(xì)菌DNA，被認(rèn)為是鑒定S.aureus的“金標(biāo)準(zhǔn)”。MRSA 在溶菌酶和溶葡萄球菌素的作用下獲得完整DNA，并通過核酸限制性內(nèi)切酶SmaⅠ或CspⅠ消化后可獲得10～20 個(gè)長約10 kb～700 kb 的DNA 片段。DNA 片段經(jīng)PFGE 分離，根據(jù)Tenover 等提出的標(biāo)準(zhǔn)[2]分為：①相同(Indistinguishable)：酶切圖譜間具有同樣的條帶數(shù)，而且相應(yīng)條帶大小相同，流行病學(xué)上則認(rèn)為相同，可認(rèn)為是同一型別；②緊密相關(guān)(Closely related)：由點(diǎn)突變、插入或缺失DNA 等導(dǎo)致的2～3 個(gè)差異條帶，很有可能是同一型別，定為亞型；③可能相關(guān)(Possibly related)：兩個(gè)獨(dú)立的基因變件可能引起4～6 個(gè)條帶的差異，也許是同一型別，可定為亞型；④不相關(guān)(Different)：3 個(gè)或更多獨(dú)立基因變異所致7 個(gè)或以上的差異條帶，可認(rèn)為在流行病學(xué)上不相關(guān)性。

1.2 多位點(diǎn)序列分型(MLST)該方法是在多位點(diǎn)酶凝膠電泳(MLEE)基礎(chǔ)之上改進(jìn)而來，S.aureus 的MLST 分型研究選擇arC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqil 7 個(gè)看家基因，PCR 擴(kuò)增、測序及序列比對，將測序結(jié)果與相應(yīng)基因的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對并截為標(biāo)準(zhǔn)長度，提交數(shù)據(jù)庫(http://www.mlst.net)獲得每株菌株各個(gè)位點(diǎn)的等位基因號，并由每株細(xì)菌7 個(gè)看家基因的等位基因號再獲得序列號(Sequence typing，STs)[3]。

1.3 SCC mec分型 該方法是根據(jù)SCC mec 染色體盒的組成元件不同為基礎(chǔ)，包括mec 基因復(fù)合體、ccr 基因復(fù)合體及mec 和ccr 基因復(fù)合體之外的J 非編碼區(qū)。由于SCC mec 染色體盒攜帶不同的基因元件，到目前它已經(jīng)被鑒定出SCC mec Ⅰ～Ⅺ共11 型(IWG-SCC)，而其中的SCC mecⅣ由于J 區(qū)的不同又被分為Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd、Ⅳg、Ⅳh、Ⅳi、Ⅳj 8 個(gè)亞型[4]。近年來SCC mec 已建立起多種分型方法，但廣泛使用的是Zhang 等建立的多重PCR 方法，該方法能同時(shí)檢測Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd 及Ⅴ8 個(gè)型[5]。

1.4 spa基因分型 Spa 蛋白是位于S.aureus 細(xì)胞壁的一種蛋白成分，具有種、屬特異性而無型的特異性。spa 分型僅涉及到spa 基因序列，該基因長約2 150 bp，包括Fc結(jié)合區(qū)、X 域和C 末端3 個(gè)區(qū)域。其中X 域含2～15 個(gè)長約21 bp～27 bp 的重復(fù)序列，該區(qū)域由于重復(fù)序列的數(shù)目、特征及排列順序不同具有高度多態(tài)性。根據(jù)spa 基因的高度重復(fù)可變序列設(shè)計(jì)引物對X 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR 產(chǎn)物測序后與數(shù)據(jù)庫中已有的型別比對。目前，已經(jīng)建立了spa 重復(fù)序列和分型數(shù)據(jù)庫(http://spa.ridom.de)，已有重復(fù)序列563 個(gè)、基因型11 372 個(gè)。

2 MRSA與寄主的關(guān)系

為研究不同宿主來源MRSA 的分子流行病學(xué)情況，對其進(jìn)行SCC mec、spa、MLST 及PFGE 等分型研究結(jié)果表明，某些菌株具有較強(qiáng)的宿主特異性，但這種特異性又在某些菌株中并非是絕對的。如，目前所知的幾種人源性流行菌株ST5-MRSA-Ⅰ、ST5-MRSA-Ⅱ、ST5-MRSA-Ⅲ、ST5-MRSA-Ⅳ、ST8-MRSA-Ⅰ、ST-MRSA-Ⅱ、ST8-MRSA-Ⅲ、ST8-MRSA-Ⅳ、ST22-MRSA-Ⅳ、ST30-MRSA-Ⅳ、ST45-MRSA-Ⅱ及ST45-MRSA-Ⅳ等未在動物中發(fā)現(xiàn)，并且具有地理性分布特點(diǎn)[6-7]。但某些MRSA 既能感染人類又能感染不同動物，如ST22-MRSA-ⅣMRSA 在人類、豬和馬中都曾被發(fā)現(xiàn)[8]；此外，最初與豬感染最為密切的ST398 LA-MRSA，后來發(fā)現(xiàn)它同樣感染奶牛、家禽、犬及馬[8]，在歐洲部分地區(qū)流行的奶牛乳房炎MRSA 的MLST 分型主要為ST398[9]。研究表明生活在養(yǎng)豬場附近人群中所攜帶的MRSA 屬于ST398 家系[10-11]。荷蘭12 %人源性MRSA 為ST398 型，而1.7 %人源性MRSA 在8個(gè)歐洲國家也檢測為ST398[12]。Sergio 等首次從亞洲地區(qū)的養(yǎng)豬場和工人上分離到ST398 LA-MRSA 菌株[13]。這表明部分MRSA 的宿主特異性并非是絕對的，有著更大的感染范圍。

3 MRSA在動物中的流行情況

3.1 MRSA在寵物中的流行情況 在社區(qū)獲得性MRSA(CA-MRSA)流行加劇的情況下，馴養(yǎng)動物特別是與人類接觸最為密切的寵物不可避免的暴露于MRSA 中，而寵物中的MRSA 又將給其它動物和人類健康帶來嚴(yán)重的威脅。在英國，首次從寵物中分離出MRSA，研究表明這些菌株屬于ST22，推測可能來源于人類。醫(yī)院內(nèi)獲得性MRSA(HA-MRSA)和CA-MRSA 也從犬中分離到，這與其犬主人有關(guān)[14]。因此，推測寵物感染或定植MRSA 與其主人、臨床獸醫(yī)師及獸醫(yī)外科手術(shù)有關(guān)。犬與攜帶MRSA的人類或其它動物接觸后，自身便成為MRSA 的寄主，只是不表現(xiàn)出臨床癥狀，在創(chuàng)傷或術(shù)后可能會導(dǎo)致MRSA的機(jī)會性感染。

3.2 MRSA在家畜中的流行

3.2.1 MRSA 在豬中的流行 引起人們關(guān)注動物源性MRSA 是源于荷蘭某養(yǎng)豬場的意外發(fā)現(xiàn)，其飼養(yǎng)員MRSA的攜帶率是荷蘭普通國民的760 倍，并且這些菌株主要是MLST ST398 MRSA。此后，ST398 MRSA 在新西蘭、丹麥、德國、葡萄牙、加拿大和美國等地區(qū)的養(yǎng)豬場檢出。起初ST398 LA-MRSA 的報(bào)道僅見于歐洲等國，但最近也在亞洲國家的養(yǎng)豬場分離到ST398 LA-MRSA。雖然ST398 在豬中的檢出率很高，但它毒力不強(qiáng)，臨床致病性感染鮮有報(bào)道。此外，其它MRSA 也在豬中發(fā)現(xiàn)，一種普遍為人所感染的USA100 菌株也從豬群中分離到，這可能是從人類傳給豬的[15]；ST9 MRSA 首次從四川雙流地區(qū)的養(yǎng)豬場分離到[16]；ST9、ST912 及ST1297 MRSA 也從中國部分地區(qū)的養(yǎng)豬場和豬場員工中分離到[17]。表明不同MRSA 可感染或定植于豬群中。

3.2.2 MRSA 在奶牛中的流行 S.aureus 是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，而牛源MRSA 自1972 年首次報(bào)道后，就引起了獸醫(yī)界的重視。在比利時(shí)，從118 株乳房炎S.aureus 中分離出11 株MRSA，分型結(jié)果表明它們屬于ST398 LA-MRSA[18]；在德國，從17 家奶牛養(yǎng)殖場臨床型乳房炎奶樣分離到25 株MRSA，牛場員工分離到2 株，均屬于MLST ST398，spa 分型為spa type011(23 株)、spa type034(3 株)、spa type2576(1 株)，主要攜帶SCC mec typeⅤ。ST398 MRSA 為歐洲國家奶牛乳房炎MRSA 的一優(yōu)勢菌 系，同樣ST8、ST1、ST239、ST329、ST8、ST425、ST130 和ST1245 在土耳其、匈牙利等歐洲國家的奶牛乳房炎奶樣中零星發(fā)現(xiàn)[9]。亞洲地區(qū)關(guān)于奶牛乳房炎MRSA的研究報(bào)道較少，來自日本和韓國地區(qū)的研究報(bào)道表明，ST5、ST580、ST1 和ST72 MRSA 也從牛奶樣中檢出[9]。最近，Garcia-Alvarez 等第一次從奶牛乳房炎奶樣中檢出攜帶SCC mecⅪ染色體盒的MRSA[19]。表明ST398 與其它STs MRSA 都能引起奶牛乳房炎，而且存在地區(qū)性差異，雖然感染率并不高，但它的威脅仍很大。例如像ST398這樣物種特異性不強(qiáng)且具有傳播性的菌株，一旦在牛群中傳播開來將會給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的威脅。

3.2.3 MRSA 在馬中的流行 MRSA 感染或定植于馬主要與環(huán)境、創(chuàng)傷和與其接觸者等有關(guān)。在人群中流行的USA500 ST8 MRSA 和ST254 MRSA 均在馬中發(fā)現(xiàn)，推測是源于人類[20-21]；ST398 MRSA 也在馬中發(fā)現(xiàn)，其定植率達(dá)10.9 %[22]。不同MRSA 可感染或定植于馬，給馬的健康帶來潛在性威脅。

3.3 MRSA在家禽中的流行 MRSA 感染和定植家禽的報(bào)道并不多見。從肉雞樣品中分離出的8 株MRSA，分型表明均屬于spa type t1456，MLST 分型的ST398[23]。從雞肉、火雞肉及其加工產(chǎn)品中也分離到37.2 %(32/86)的MRSA，其中28 株的MLST 分型為ST398，spa 分型為t011、t034、t899、t2346 及t6574，含SCC mec typeⅣ或Ⅴ；2 株的MLST 分型為ST9，攜帶SCC mec 染色體盒和spa type t1430；剩余2 株分別屬于MLST 分型的ST5 和ST1791，都攜帶SCCmec typeⅢ染色體盒，都是spa 分型的t002[24]。

4 MRSA在人與動物之間相互傳播的情況

多數(shù)關(guān)于MRSA 在不同物種間傳播的研究，是對分離自不同動物和與其直接或間接接觸人類的MRSA 做耐藥譜型和分子分型。研究資料顯示，源于動物和人的MRSA 無法用基因型和耐藥普型加以區(qū)分，所以推測是MRSA 在人與動物之間相互傳播，但MRSA 在不同物種間傳播目前仍尚無定論。一種不能用PFGE 分型，MLST分型為ST398，攜帶spa-type108 和SCC mec type Ⅴ的LA-MRSA 從豬、豬場員工及一位豬場員工的妻子和幼女中分離到，表明其在人類和豬之間相互傳播[25]。MRSA 在人和奶牛間的傳播也有報(bào)道，27 株分離自亞臨床型奶牛乳房炎和一株牛場員工的MRSA 無法通過耐藥譜型和基因型加以區(qū)分，表明存在MRSA 在奶牛和人之間相互傳播的可能[26]。類似情況也在寵物和人之間發(fā)生，從一只健康犬和攜帶MRSA 主人上分離的兩株MRSA 具有完全一樣的PFGE 和SCC mec 分型結(jié)果，表明MRSA 可能從人傳播到犬[27]。種種事實(shí)表明，可能存在MRSA 在人和動物間相互傳播的現(xiàn)象，雖然目前不能確定具體的傳播方，但MRSA 在不同物種間的傳播必將引起公眾對社會公共衛(wèi)生安全的高度擔(dān)憂。

5 結(jié)語

細(xì)菌在抗生素的持續(xù)選擇壓力下，對其產(chǎn)生的抗性也越來越強(qiáng)。雖然目前很難斷言MRSA 給公共衛(wèi)生安全帶來多大的危害，但作為人和動物感染的主要病原菌，它確實(shí)已給人類疾病的防治造成極大的困難；同時(shí)，對動物健康、獸醫(yī)臨床及食品安全具有很大的威脅挑戰(zhàn)，因此，對不同感染源及地域的MRSA 進(jìn)行深入的流行病學(xué)研究顯得尤為重要。

[1]Van Belkum A,Melles D C,Nouwen J,et al.Co-evolutionary aspects of human colonization and infection by Staphylococcus aureus[J].Infect Genet Evol,2009,9:32-47.

[2]Tenover F C,Arbeit R D,Goering R V,et al.Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis:Criteria for bacterial strain typing[J].J Clin Microbiol,1995,33:2233-2239.

[3]Enright M C,Day N P,Davies C E,et al.Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aurues[J].J Clin Microbiol,2000,38(3):1008-1015.

[4]Milheirico C,Oliveira D C,de Lencastre H.Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type Ⅳin methicillin-resistant Staphylococcus aureus:□SCC mec Ⅳ multiplex'[J].J Antimicrob Chemother,2007,60:42-48.

[5]Zhang Kun-yan,McClure J A,Elsayed S,et al.Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types Ⅰto Ⅴin methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].J Clin Microbiol,2005,43(10):5026-5033.

[6]Monecke S,Coombs G,Shore A C,et al.A field guid to pandemic,epidemic and sporadic clones of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].PloS One,2011,6:e17936.

[7]Enright M C,Robinson A,Randle G,et al.The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)[J].PNAS,2002,99:7687-7692.

[8]Cuny C,Friedrich A,Svetlana K,et al.Emergency of methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)in different animal species[J].Int J Med Microbiol,2010,300:109-117.

[9]Holmes M A,Zadoks R N.Methicillin resistant S.aureus in human and bovine mastitis[J].J Mammary Gland Biol Neoplasia,2011,16:373-382.

[10]Voss A,Loeffen F,Bakker J,et al.Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in pig farming[J].Emerg Infect Dis,2005,11:1965-1966.

[11]Armand-Lefevre L,Ruimy R,Andremont A.Clonal comparison of Staphylococcus aureus isolates from healthy pig farmers,human controls,and pigs[J].Emerg Infect Dis,2005,11:711-714.

[12]Cleef B A V,Monnet D L,Voss A,et al.Livestock-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus in humans,Europe[J].Emerg Infect Dis,2011,17:502-505.

[13]Sergio D M,Koh T H,Hsu L Y,et al.Investigation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in pigs used for research[J].J Med Microbiol,2007,56:1107-1109.

[14]Boost M V,O'Donoghue M M,Siu K H G.Characterisation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from dogs and their owners[J].Clin Microbiol Infect,2007,13:731-733.

[15]Khanna T,Friendship R,Dewey C,et al.Methicillin resistant Staphylococcua aureus colonization in pigs and pig farmers[J].Vet Microbiol,2008,128:298-303.

[16]Wagenaar J A,Yue Hong,Pritchard J,et al.Unexpected sequence types in livestock associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA):MRSA ST9 and a single locus variant of ST9 in pig farming in China[J].Vet Microbiol,2009,139:405-409.

[17]Cui Sheng-hui,Li Jing-yun,Hu Chang-qin,et al.Isolation and characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus from swine and workers in China[J].J Antimicrob Chemother,2009,64:680-683.

[18]Vanderhaeghen W,Cerpentier T,Adriaensen C,et al.Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)ST398 associated with clinical and subclinical mastitis in Belgian cows[J].Vet Microbiol,2010,144:166-171.

[19]Garcia-Alvarez L,Holden M T,Lindsay H,et al.Methicillinresistant Staphylococcus aureus with a novel mecA homologue in human and bovine populations in the UK and Denmark:a descriptive study[J].Lancet Infect Dis,2011,11(8):595-603.

[20]Moodley A,Nightinale E C,Stegger M,et al.High risk for nasal carriage of methicillin-resistant Staphylococcus aureus among Danish veterinary practitioners[J].Scand J Work Environ Health,2008,34:151-157.

[21]Cuny C,Kuemmerle J,Stanek C,et al.Emergence of MRSA infections in horses in a veterinary hospital:strain characterization and comparison with MRSA from humans[J].Euro Surveill,2006,11:44-47.

[22]Eede A V D,Martens A,LIPINska U,et al.High occurrence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus ST398 in equine nasal samples[J].Vet Microbiol,2009,133:138-144.

[23]Persoons D,Hoorebeke S V,Hermans K,et al.Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus in Poultry[J].Emerg Infect Dis,2009,15(3):452-453.

[24]Fesler A T,Kadlec K,Hassel M,et al.Characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from food and food products of poultry origin in Germany[J].Appl Environ Microbiol,2011,77(20):7151-7157.

[25]Huijsdens X W,Dijke B J V,Spalburg E,et al.Communityacquired MRSA and pig-farming[J].Ann of Clin Microbiol Antimicrob,2006,5:26-30.

[26]Juhász-KaszanyitzkyJánosi S,Somogyi P,et al.MRSAtransmission between cows and humans[J].Emerg Infect Dis,2007,13(4):630-632.

[27]Duijkeren E V,Wolfhagen M J H M,Box A T A,et al.Human-to-dog transmission of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].Emerg Infect Dis,2004,12(10):2235-2237.