於紹龍，劉丹平

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院;2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121001)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP)-2 是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因(trans-forming growth factor，TGF)-β超家族的生長(zhǎng)因子，為促進(jìn)骨形成和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化最重要的細(xì)胞外信號(hào)分子之一。在骨形成過(guò)程中，BMP-2 作為啟動(dòng)調(diào)節(jié)因子促進(jìn)新骨形成，并且在出生后，BMP-2 也參與骨骼動(dòng)態(tài)平衡的維持。骨組織生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝和衰老表現(xiàn)為骨量增加或減少，在組織學(xué)上則以骨生成和骨重建方式進(jìn)行，表現(xiàn)為骨組織細(xì)胞分化、增殖、凋亡。其中涉及的多條信號(hào)通路中BMP-2/Smads/Runx2 信號(hào)通路對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞外基質(zhì)合成、分泌顯得尤為重要。

1 BMP-2 及其受體

BMPs 是TGF-β 超家族中的成員之一，為廣泛存在于骨基質(zhì)中的酸性糖蛋白，目前已有20 余種成員，是較強(qiáng)的成骨因子［1］。其中BMP-2 是促進(jìn)骨形成和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化最重要的細(xì)胞外信號(hào)分子之一，其在體內(nèi)以自分泌和旁分泌的形式誘導(dǎo)骨、軟骨及骨相關(guān)結(jié)締組織的形成［2］。

BMP-2 含有兩種受體，分別為I 型受體(bone morphogenetic protein receptor I，BMPR-I)和II 型受體(bone morphogenetic protein receptor II，BMPR-II)［3］。兩種受體是跨膜的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在胞內(nèi)區(qū)具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，該受體以二聚體行使功能。BMPR-I 為單次跨膜的糖蛋白受體，在BMPR-I 的胞漿區(qū)蛋白激酶結(jié)構(gòu)N 段和細(xì)胞之間，存在一個(gè)富含絲氨酸(Serine，Ser)和甘氨酸(Glycine，Gly)的結(jié)構(gòu)域，稱為GS 結(jié)構(gòu)域，有若干的磷酸化位點(diǎn)，GS 結(jié)構(gòu)域中有一段保守的Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 序列，稱為GS 序列，為BMPR-I 所特有，可以被BMPR-II 激酶磷酸化，從而使BMPR-I 型受體磷酸化，向胞內(nèi)傳遞胞外信號(hào)［4］。BMPR-II 與BMPR-I結(jié)構(gòu)類似，但與BMPR-I 的不同點(diǎn)為:分子量稍大;細(xì)胞膜外區(qū)較BMPR-I 長(zhǎng);無(wú)GS 結(jié)構(gòu)域;具有不依賴配體的組成性激酶活性，但可以與BMP-2 結(jié)合［5］。BMP-2 與細(xì)胞表面BMPR-I 和BMPR-II 結(jié)合而激活，通過(guò)激活下游Smads 信號(hào)調(diào)節(jié)成骨基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮其成骨作用。

2 Smads

Smads 蛋白家族是近年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，直接參與TGF-β 超家族成員的信號(hào)傳導(dǎo)。目前發(fā)現(xiàn)9 個(gè)亞型，即Smad1～9。Smads 家族成員結(jié)構(gòu)類似，由Mad 以及Sma 兩個(gè)相關(guān)等位基因編碼?；窘Y(jié)構(gòu)主要由3 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成:保守氨基端(N 段)MH1 區(qū)，為Mad 類似物1，主要與DNA 結(jié)合，但在Smads 未激活之前，它也有抑制MH2轉(zhuǎn)錄激活的作用;羧基端(C 段)MH2 區(qū)，為Mad 類似物2，它參與Smads 與受體的結(jié)合以及Smads 之間的聚合體的形成，MH2 區(qū)也有抑制MH1 區(qū)與DNA 結(jié)合的作用;中央鏈接區(qū)，為富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)，可將MH2 區(qū)及MH1 區(qū)鏈接成一個(gè)完整的分子。該連接區(qū)內(nèi)有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，被磷酸化激活后可以抑制Smads 蛋白的核轉(zhuǎn)移，是Smads蛋白的負(fù)調(diào)控區(qū)域［6］。

根據(jù)結(jié)構(gòu)以及在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用將Smads 蛋白分為3類:(1)受體調(diào)節(jié)型Smad (Receptor activated Smad，R-Smad)，包 括 Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8、Smad9，其中Smad1、Smad5、Smad8 可調(diào)節(jié)BMP-2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。R-Smad 蛋白C 端功能域末端含有絲氨酸-絲氨酸-任意氨基酸-絲氨酸(Ser-Ser-X-Ser，SSXS)磷酸化位點(diǎn)，可與BMPR-I 直接作用并被磷酸化，磷酸化的R-Smad 與Co-Smad 形成復(fù)合物后可轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)靶基因?qū)MP-2 信號(hào)的表達(dá);(2)共同介質(zhì)型Smad(Common Smad，Co-Smad)，哺乳動(dòng)物類只有Smad4，被磷酸化后與R-Smad 形成雜聚體，然后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。它的C 端功能域沒(méi)有磷酸化位點(diǎn)，不能與BMPR-1 相互作用，也不能被磷酸化，但它可以與Smad家族中的其它成員相互作用并形成穩(wěn)定的異源三聚體。這種三聚體的形成是BMP-2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所必須，Smad4 缺陷的細(xì)胞不再對(duì)BMP-2 信號(hào)產(chǎn)生應(yīng)答，而轉(zhuǎn)染野生型Smad4可以重建其表達(dá)［7］;(3)抑制性Smad (Inhibitory Smad，I-Smad)，包括Smad6，Smad7，對(duì)信號(hào)通路發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上和其它的Smad 成員有很大的不同，C 端功能域缺乏磷酸化位點(diǎn)，沒(méi)有保守的MH1 功能域，而只在MH2 功能域與其它的Smad 具有較大的同源性。I-Smad 與R-Smad 競(jìng)爭(zhēng)性與BMPR-I 結(jié)合，干擾R-Smad 與BMPR-I 結(jié)合以及磷酸化，從而抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在BMP-2 信號(hào)通路中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。經(jīng)典的Smads 通路是R-Smads 激活后與Co-Smad 形成復(fù)合體，共同轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄［8］。

3 Runx2

Runxs 是新發(fā)現(xiàn)的一類調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，它們的分子結(jié)構(gòu)中均含有一個(gè)由128個(gè)氨基酸組成的DNA 結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與果蠅屬的分節(jié)基因Runt 同源，因此而被稱為Runt 結(jié)構(gòu)域。Runxs 包含三個(gè)亞型，Runx1、Runx2 和Runx3。Runx1 是紅細(xì)胞形成所必需的蛋白，人類白血病中常見(jiàn)多種染色體易位于Runx1 基因，其突變可導(dǎo)致急性骨髓細(xì)胞性白血病。Runx3 則參與神經(jīng)元形成、胸腺激素生成以及腫瘤抑制作用，它的突變與胃癌發(fā)生相關(guān)。Runx2 又稱核結(jié)合因子(core-binding factor subunit alpha-1，Cbfα1)，為重要的成骨細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子。Runx2 參與調(diào)控成骨細(xì)胞分化進(jìn)程中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的基因表達(dá)，同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)軟骨、成骨細(xì)胞的分化完成對(duì)骨生成的控制，對(duì)成骨細(xì)胞的成熟、穩(wěn)定起了重要的作用［9］。

Runx2 存存在3 個(gè)轉(zhuǎn)錄激活域(AD)、1 個(gè)抑制區(qū)域(RD)和1 個(gè)短的Myc 相關(guān)核定位信號(hào)(nuclear localization signal，NLS)。它的3 個(gè)激活結(jié)構(gòu)域(AD1、AD2、AD3)中主要的激活結(jié)構(gòu)域?yàn)锳D3，AD1、AD2 的結(jié)構(gòu)域使Runx2具有強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄能力，但是不能自主活化轉(zhuǎn)錄。Runx2 能通過(guò)C 末端區(qū)域與Smads 蛋白相互作用形成共調(diào)節(jié)子，激活或者阻遏表達(dá)。Runx2 的C 末端區(qū)域含有核基質(zhì)定位信號(hào)(nuclear matrix targeting signal NMTS)可將Runx2 定位在核內(nèi)區(qū)域調(diào)控骨特異性基因轉(zhuǎn)錄，此信號(hào)序列與Smads 相互作用的區(qū)域相互重疊，一旦此區(qū)域發(fā)生突變成骨細(xì)胞分化不能正常進(jìn)行骨發(fā)育出現(xiàn)缺陷［10］。

Runx2 的表達(dá)受到參與成骨細(xì)胞分化的多種生長(zhǎng)因子和激素的調(diào)控，BMPs 是成骨細(xì)胞分化和骨形成最有效的誘導(dǎo)因子，可以通過(guò)Smads 途徑上調(diào)Runx2 的表達(dá)。過(guò)氧化物酶體增殖因子激活受體γ2 抑制其表達(dá)和成骨細(xì)胞分化，腫瘤壞死因子α、1-25-(OH)2D3、糖皮質(zhì)激素可能抑制或降低Runx2 的表達(dá)。Runx2 亦可通過(guò)自身啟動(dòng)子的負(fù)調(diào)控機(jī)制自動(dòng)調(diào)控。Runx2 的表達(dá)及功能在鼠的Runx2 啟動(dòng)子區(qū)至少有3 個(gè)Runx2 識(shí)別位點(diǎn)，強(qiáng)制表達(dá)Runx2 蛋白可以下調(diào)Runx2 啟動(dòng)子活性。一個(gè)Runx2 位點(diǎn)就足以抑制轉(zhuǎn)錄，這種自我調(diào)控嚴(yán)格控制Runx2 的表達(dá)從而調(diào)控骨相關(guān)基因的表達(dá)和成骨分化［11］。

4 BMP-2/Smads/Runx2 信號(hào)通路

BMP-2 通過(guò)結(jié)合靶細(xì)胞表面2 種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(BMPR-I，BMPR-II)

向胞內(nèi)傳遞信號(hào)。BMP-2 與持續(xù)表現(xiàn)激酶活性的BMPR-II 結(jié)合后，BMPR-I 能夠特異性與此二聚體結(jié)合而發(fā)生自身磷酸化。BMPR-I 再通過(guò)磷酸化Smad1 或Smad5 使其活化，被激活的Smad1 或Smad5 結(jié)合Smad4 進(jìn)入胞核，調(diào)節(jié)特定基因轉(zhuǎn)錄的功能。Smads 蛋白作為共調(diào)節(jié)子和Runx2 相互作用共同參與成骨細(xì)胞表型基因表達(dá)和分化。用外源的BMP-2 可以啟動(dòng)信號(hào)通路激活Smads 復(fù)合物調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，但是Smads 復(fù)合物對(duì)基因調(diào)節(jié)的特異性較低，下游基因的特異表達(dá)需要特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2的參與［12］。Runx2 可以和骨鈣蛋白啟動(dòng)子區(qū)的成骨細(xì)胞特異性順式作用元件2 (Osteoblast-specific cis-acting element 2，OSE2)相結(jié)合刺激骨鈣蛋白的表達(dá)，在I 型膠原、骨涎蛋白及骨橋蛋白等成骨細(xì)胞相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)都有OSE2 樣元件，Runx2 能與這些OSE2 樣元件結(jié)合激活這些基因表達(dá)［13］。

Runx2 能與Smads 蛋白共同調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞膠原的表達(dá)，Runx2 可以直接結(jié)合到OSE2 上轉(zhuǎn)錄激活骨鈣蛋白基因的啟動(dòng)子。而Smad1 和Smad5 自身不能結(jié)合到OSE2 上只有在Runx2 的幫助下才能結(jié)合到OSE2 上轉(zhuǎn)錄激活骨鈣蛋白啟動(dòng)子。Runx2 通過(guò)其C 末端的核基質(zhì)定位信號(hào)將Smads 定位在核內(nèi)活躍轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)，兩者形成復(fù)合物與核基質(zhì)結(jié)合共同調(diào)控基因表達(dá)和細(xì)胞分化。該核基質(zhì)定位信號(hào)對(duì)Runx2 在核內(nèi)的精確定位及Runx2 依賴性分化基因的表達(dá)調(diào)控是必要的。Runx2 C 末端刪除純合小鼠因?yàn)槌晒羌?xì)胞成熟受阻而不能成骨，Smads 和Runx2 相互作用并增強(qiáng)Runx2 對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活活性［14］。

5 相關(guān)調(diào)節(jié)因子

5.1 Smurf 1 Smurf 1 即泛素化調(diào)節(jié)因子1，屬于E3 泛素連接酶家族。它與BMP-2 信號(hào)蛋白Smad1、Smad5 及成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2、BMPR-I 相互作用，調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)在蛋白酶體中被降解。Chen［15］等研究發(fā)現(xiàn)，Smurf1 與BMP-2 激活的Smad1、Smad5 相互作用并調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2 降解，闡明Smurf1 在體內(nèi)成骨分化和骨形成中具有特定作用。Xing 等［16］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Smad6、Smurf1 和Runx2 均位于細(xì)胞核，Smad6 與Smurf1 的協(xié)同作用可下調(diào)Runx2 蛋白水平，為BMP-2/Smads/Runx2 信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制。

5.2 Menin Menin 即1 型多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤腫瘤抑制基因產(chǎn)物。作為一種核蛋白，它在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、基因組穩(wěn)定、細(xì)胞分裂和增殖方面發(fā)揮作用，可促進(jìn)多能間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，抑制成骨細(xì)胞晚期分化。Menin 通過(guò)BMP-2/Smad1 (Smad5)/Runx2 級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，Menin 與Smad3 共同增強(qiáng)BMP-2 誘導(dǎo)的Smad1/Smad5、Runx2 的轉(zhuǎn)錄活性［17］。

5.3 Cthrc1 Cthrc1 為膠原三股螺旋重復(fù)蛋白1，作為成骨細(xì)胞骨形成的正性調(diào)節(jié)可使骨量增加。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)Cthrc1作為成軟骨組細(xì)胞樣細(xì)胞BMP-2 的下游基因，在活體組織中表達(dá)［18］。對(duì)于無(wú)Cthrc1 鼠或者轉(zhuǎn)基因鼠獲得的骨髓細(xì)胞集落形成單位的體外研究表明其可以刺激骨組細(xì)胞分化和礦化，在無(wú)Cthrc1 鼠生長(zhǎng)初期堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)，I 型膠原和骨鈣素(Ostccalcin，OC)表達(dá)減少［19-20］。

成骨細(xì)胞的分化成熟及礦化是骨發(fā)生和骨折等愈合的基礎(chǔ)，該過(guò)程通過(guò)相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)啟動(dòng)骨特異性轉(zhuǎn)錄因子和生長(zhǎng)因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨并完成骨修復(fù)功能。BMP-2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化和成骨細(xì)胞的分化成熟方面起著至關(guān)重要的作用。大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，BMP-2 信號(hào)通路參與成骨細(xì)胞分化以及骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)合成與分泌，促進(jìn)骨形成，增加骨量。研究該通路蛋白和影響通路的相關(guān)因子可作為開(kāi)發(fā)抗骨質(zhì)疏松、骨腫瘤或促進(jìn)骨愈合藥物的靶標(biāo)，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)，同時(shí)也為藥物研究及分子機(jī)制提供依據(jù)。

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