畢明剛，于 蕾，于 淼，東 方，王 崴，劉光達，李海嬌，周 賀

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱150076;2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物研究所博士后科研工作站，哈爾濱150076;3.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱150076)

多糖具有療效確切的抗腫瘤作用，部分多糖如 黃芪多糖、香菇多糖等也已應(yīng)用于臨床.但由于多糖構(gòu)成組分眾多且雜質(zhì)較多，而其結(jié)構(gòu)又高度復(fù)雜，導(dǎo)致目前對于多糖構(gòu)效關(guān)系的研究并不十分深入和明確，也限制了多糖的應(yīng)用.研究證實，植物多糖發(fā)揮生物活性主要物質(zhì)基礎(chǔ)在于其獨特化學(xué)組分上[1－4]，因此，研究除去雜質(zhì)的多糖組分對深入研究多糖構(gòu)效關(guān)系至關(guān)重要.野西瓜多糖為野西瓜(Capparis spinosa L.)果實中質(zhì)量濃度較高的成分之一，本文研究野西瓜分離純化過程及其質(zhì)量濃度，為繼續(xù)深入研究野西瓜多糖奠定基礎(chǔ).

1 實驗材料與實驗方法

1.1 實驗材料

野西瓜粗多糖:哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心提供.

實驗試劑:95%乙醇、無水乙醇、丙酮、石油醚、過氧化氫、氯化鋇(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，正丁醇(天津市津宇細化工有限公司)，氯仿(天津博迪化工股份有限公司)，三氯乙酸(上海山浦化工有限公司)，氨水(天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠)，苯酚(天津市光復(fù)精細化工研究所)，濃硫酸(北京化工廠)，氯化鈉(天津市巴斯夫基化工有限公司)，DEAE －52(Whatman公司)、Sephadex G －200(Pharmacia公司)、葡萄糖(曹陽第二試劑廠)，硫酸鉀(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)，明膠(天津市化學(xué)試劑三廠)，葡萄糖醛酸(上海達瑞精細化學(xué)品有限公司)、咔唑(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)、試劑均為分析純，木瓜蛋白酶(＞5×105U/g，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司).

實驗儀器:752型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)，Waters高效液相色譜儀(Waters公司)，BS－160A自動部分收集器(上?？等A生化儀器制造廠)，HL－2B數(shù)顯恒流泵(上海康華生化儀器制造廠).

1.2 實驗方法

1.2.1 野西瓜多糖分離純化流程

稱取10 g粗多糖溶于水中，以多糖質(zhì)量分數(shù)1%的比例加入木瓜蛋白酶，放入60℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)2 h，待木瓜蛋白酶與糖溶液充分反應(yīng)后將其放入100℃的恒溫水浴鍋內(nèi)滅活10 min，除去沉淀保留清液，然后向清液中加入Sevag液(氯仿∶正丁醇 =4∶1)劇烈震蕩20 min，靜置30 min，收集上清液.將收集到的上清液按上述步驟反復(fù)操作，直至水相和有機相之間沒有白色的沉淀物出現(xiàn)，收集水相，即得到除去蛋白質(zhì)的野西瓜多糖水溶液[5－6].

將除去蛋白的野西瓜多糖水溶液用氨水調(diào)節(jié)pH值至8～9，然后向糖液中緩慢地、邊攪拌邊加入H2O2至終體積分數(shù)為10%，將其放入60℃的恒溫水浴鍋內(nèi)加熱2 h.將處理過的糖液倒入透析袋中，流水透析72 h，蒸餾水透析24 h，濃縮后，向糖液中加入乙醇至終體積分數(shù)10%，24 h后，3 500 r/min離心10 min棄去上清液，離心后所得的沉淀用無水乙醇、丙酮、石油醚抽洗，待溶劑完全揮發(fā)完所得的干燥粉末狀即為10%組分的多糖CSPSⅠ，向剩下的糖液中繼續(xù)加入無水乙醇至終體積分數(shù)為20%進行醇沉，可得20%組分的多糖CSPSII，按上述操作向糖液中加入無水乙醇，分別調(diào)終體積分數(shù)至30%、40%、50%、60%、70%、80%，分別得到組分 CSPSШ、CSPSⅣ、CSPSⅤ、CSPSⅥ、CSPSⅦ、CSPSⅧ.

將除去蛋白及色素的CSPSⅠ進行DEAE－52柱層析，依次用 4 倍柱體積雙蒸水、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、0.8 mol/L NaCl洗脫劑洗脫，自動收集器收集洗脫液，苯酚－硫酸法隔管檢測，合并單一峰，流水透析3 d、蒸餾水透析2 d，至無Cl－后冷凍干燥.

1.2.2 純度鑒定

取CSPSⅠC適量，以0.05 mol/L NaCl為洗脫劑，進行Sephadex G －200(1.6×80 cm)柱層析，自動部分收集器收集，苯酚－硫酸法隔管檢測.

1.2.3 CSPSⅠC 糖質(zhì)量濃度測定

1)葡萄糖標準曲線制備

分別吸取0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分別加入到 20 mL試管中，依次添加蒸餾水補充體積至2.0 mL，各管再加入6%苯酚1.0 mL，混勻，迅速加入濃硫酸5 mL，靜置5 min后，置于沸水中加熱20 min，取出冷卻至室溫，490 nm處測定吸光度，以葡萄糖的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度值(A)為縱坐標，繪制標準曲線.

2)樣品質(zhì)量濃度測定

精密吸取0.1 mg/mL CSPSⅠC溶液 1 mL，置于20 mL試管中，加入蒸餾水至終體積2.0 mL，在加入6%苯酚1.0 mL，混勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，靜置5 min后，置于沸水中加熱20 min，取出冷卻至室溫，490 nm處測定吸光度，依據(jù)回歸方程計算多糖質(zhì)量濃度[7].

1.2.4 CSPSⅠC糖醛酸質(zhì)量濃度測定

1)標準曲線的制作

分別吸取0.1 mg/mL葡萄糖醛酸標準品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于 10 mL 具塞試管中，各管加水至1 mL，分別在冰水浴中加入濃硫酸溶液5 mL，混勻后于沸水浴中加熱20 min，取出后立即冷卻至室溫，加0.1%咔唑溶液0.2 mL，搖勻，在室溫下保持2 h，在最佳測定波長下測定其吸光度.以糖醛酸質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線.

2)樣品溶液中糖醛酸質(zhì)量濃度的測定

精密吸取0.1 mg/mL CSPSⅠC溶液1 mL，以蒸餾水同法操作為參比，按上述標準曲線的測定方法，測定其吸光度值，計算糖醛酸的質(zhì)量濃度[8].

1.2.5 CSPSⅠC硫酸基質(zhì)量濃度測定

1)標準曲線的制備

分別取0.1 mg/mL硫酸鉀標準品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，放入 8 支試管中，加水至2.0 mL，再加入8%三氯乙酸1.40 mL和0.5%氯化鋇明膠溶液1.00 mL，混合.混合物靜置20 min，在360 nm波長下測定濁度.記錄吸光度值A(chǔ)1，再以0.5%明膠溶液1.00 mL代替氯化鋇明膠溶液測定，記錄吸光度值A(chǔ)2，以A1－A2為縱坐標，硫酸鉀標準品的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標，作標準曲線.

2)樣品的測定

稱取6mg CSPSⅠC置于安瓿中，加入1.0 mL 1 mol/L HCl，密封，100 ℃水解6 h.冷卻后開啟安瓿管，內(nèi)容物于40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸干，殘渣溶解于4.0 mL水中.取0.2 mL水解液放入試管中，加水至2.0 mL，加入三氯乙酸1.4 mL、氯化鋇明膠溶液1.00 mL，混合靜置20 min，360 nm 下測定濁度(A1).再取0.2 mL水解液置于試管中，加水至2.0 mL，加入三氯乙酸 1.4 mL，明膠 1.00 mL 混合，靜置 20 min，360 nm 下測定濁度(A2)[9－10].

1.2.6 CSPSⅠC 相對分子質(zhì)量測定

1)高效液相凝膠色譜法色譜條件

儀器:Waters 2695 Separation Module型HPLC主機;色譜柱:UltrahydrogelTMLinear(7.8×300 mm);流動相:雙蒸水;檢測器:Waters 2414示差檢測器;進樣量:20 μL;流速:0.8 mL/min;柱溫:40℃

2)標準曲線的繪制

將標準葡聚糖 T10、T40、T70、T110、T500，葡萄糖(用于測定柱總體積Vt)和藍色葡聚糖(用于測定柱空體積V0)各2 mg分別溶于1 mL雙蒸水中，制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL，0.45 μm 濾膜過濾，按分子質(zhì)量從小到大分別進樣，記錄洗脫峰的保留時間(RT).

根據(jù)經(jīng)驗公式，多糖分子質(zhì)量MW與其在凝膠柱上的洗脫體積Ve、分配系數(shù)Kav存在如下關(guān)系:

K1、K2為常數(shù)，以標準分子質(zhì)量的對數(shù)值(lgMW)為縱坐標，以Kav為橫坐標進行線性回歸.

3)樣品分子質(zhì)量的測定

精確稱取CSPSⅠC 2mg雙蒸水定容到1 mL，制成2 mg/mL溶液，0.45 μm濾膜過濾，相同色譜條件下分析，記錄保留時間(RT)，經(jīng)回歸方程求得分子質(zhì)量.

2 實驗結(jié)果與分析

2.1.1 CSPS 分步醇沉結(jié)果

CSPS分步醇沉結(jié)果如表1所示，從表1中可以看出，10%醇沉部位多糖所占比例最大，質(zhì)量為3.404 5 g，其次為20%醇沉部位，30% ～80%醇沉部位所占比率較小.說明CSPS中多糖分布很不均勻，10%醇沉部分應(yīng)為高分子質(zhì)量多糖.20% ～80% 醇沉部位應(yīng)為小分子糖和雜質(zhì).因此，本文選取CSPSⅠ(10%醇沉部位)作為研究對象.

表1 CSPS不同醇沉部位多糖質(zhì)量

2.1.2 CSPSⅠDEAE －52 柱層析結(jié)果

使用不同濃度 NaCl洗脫劑(蒸餾水、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、0.8 mol/L)對 CSPSⅠ進行 DEAE －52 柱層析.其中，0.1 mol/L NaCl洗脫所得組分CSPSⅠC糖質(zhì)量濃度最高.CSPSⅠC洗脫曲線如圖1所示.因此，本文選取CSPSⅠC作為研究對象，流水透析至無Cl－后濃縮、凍干即得CSPSⅠC.

2.1.3 CSPSⅠC 純度檢測結(jié)果

取溶于0.05 mol/LNaCl中的 CSPSⅠC進行Sephadex G－200柱層析，自動部分收集器收集，苯酚－硫酸法檢測，繪制洗脫曲線，見圖2.從圖形可知CSPSⅠC經(jīng)過Sephadex G－200柱層析后，峰型單一對稱，純度較好.

圖1 0.1mol/L NaCl洗脫劑下CSPSⅠ洗脫曲線

圖2 CSPSⅠC Sephadex G－200柱層析

2.1.4 CSPSⅠC糖質(zhì)量濃度測定結(jié)果

1)葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線見圖3所示.其線性回歸方程為 y=0.014 3x+0.007，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 4.糖質(zhì)量濃度在0～70 μg/mL線性較好.

圖3 葡萄糖標準曲線

2)糖質(zhì)量濃度測定結(jié)果

CSPSⅠC中糖質(zhì)量濃度結(jié)果如表2所示，CSPSⅠC平均糖質(zhì)量濃度為82.83%，遠高于野西瓜粗多糖38.60%的糖質(zhì)量濃度，表明經(jīng)除蛋白、色素和小分子后，所得的CSPSⅠC糖質(zhì)量濃度較高.

表2 野西瓜粗多糖及CSPSⅠC糖質(zhì)量濃度測定

3)CSPSⅠC糖質(zhì)量濃度測定方法學(xué)考察

經(jīng)方法學(xué)考察，穩(wěn)定性較高，RSD=0.17%，精密度較好 RSD=0.17%，重復(fù)性較好，RSD=3.34%.

2.1.5 CSPSⅠC糖醛酸質(zhì)量濃度測定結(jié)果

1)葡萄糖醛酸標準曲線

葡萄糖醛酸標準曲線如圖4所示.其線性回歸方程為 y=0.003 7x －0.003 3，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 7.糖質(zhì)量濃度在0 ～100 μg/mL 線性較好.

2)CSPSⅠC中葡萄糖醛酸質(zhì)量濃度測定結(jié)果

CSPSⅠC中葡萄糖醛酸質(zhì)量濃度結(jié)果如表3所示，平行檢測3次，經(jīng)計算，CSPSⅠC平均糖質(zhì)量濃度為23.59%.

3)CSPSⅠC葡萄糖醛酸質(zhì)量濃度測定方法學(xué)考察

經(jīng)方法學(xué)考察，穩(wěn)定性較好(RSD=0.95%)，精密度較好(RSD=0.60%)，重復(fù)性較好(RSD=3.57%)，表明該方法穩(wěn)定可靠.

2.1.6 CSPSⅠC硫酸基質(zhì)量濃度測定結(jié)果

1)硫酸基標準曲線

硫酸基標準曲線見圖5所示.其線性回歸方程為 y=0.004 7x －0.033 7，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 2.糖質(zhì)量濃度在0～70 μg/mL線性較好.

2)硫酸基質(zhì)量濃度測定結(jié)果

CSPSⅠC中硫酸基平行檢測3次，質(zhì)量濃度結(jié)果如表4所示，CSPSⅠC平均硫酸基糖質(zhì)量濃度為16.22%.

3)CSPSⅠC硫酸基質(zhì)量濃度測定方法學(xué)考察

經(jīng)方法學(xué)考察，穩(wěn)定性較高(RSD=1.02%)，精密度較好(RSD=0.51%)，重復(fù)性較好(RSD=1.54%)，表明該方法穩(wěn)定可靠.

圖4 葡萄糖醛酸標準曲線

圖5 硫酸基標準曲線

表3 CSPSⅠC葡萄糖醛酸質(zhì)量分數(shù)

表4 CSPSⅠC硫酸基質(zhì)量分數(shù)

2.1.7 CSPSⅠC相對分子質(zhì)量測定結(jié)果

根據(jù)公式分別計算出的不同葡聚糖對應(yīng)lgMW、Kav繪制標準曲線.如圖6所示，其線性回歸方程為 lgMW= －5.615 3Kav+7.957 3，相關(guān)系數(shù) r=0.990.經(jīng)計算，CSPSⅠC 相對分子質(zhì)量為 6.23×107.

圖6 分子質(zhì)量測定標準曲線

3 結(jié)語

本文首先對野西瓜多糖進行了分離純化，通過木瓜蛋白酶－Sevag聯(lián)用法脫除多糖中蛋白，并通過雙氧水及透析袋除去多糖色素和小分子雜質(zhì).采用分步醇沉法，得到10%醇沉部位多糖(CSPSⅠ)所占比例最大，以CSPSⅠ為DEAE－52柱層析對象，得到了糖質(zhì)量濃度最高的組分CSPSⅠC，并通過純度檢測證實CSPSⅠC純度較高.CSPSⅠC的糖質(zhì)量分數(shù)、糖醛酸質(zhì)量分數(shù)、硫酸基及相對分子質(zhì)量測定結(jié)果分別為 82.83%、23.59%、16.22%、6.23×107，通過對野西瓜多糖分離純化及質(zhì)量濃度測定為繼續(xù)深入研究野西瓜多糖奠定了基礎(chǔ).

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