李 靜 尚平平 楊 洋 何 姣 喬博靈

(1 西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西省生物醫(yī)藥重點實驗室,西安,710016; 2 陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院藥用植物資源與天然藥物化學(xué)教育部重點實驗室,西安,710119)

隨著生活物質(zhì)的極大豐富,人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大的變化,高尿酸血癥成為現(xiàn)代人的高發(fā)疾病之一[1]。高尿酸血癥是患者體內(nèi)嘌呤類物質(zhì)代謝紊亂,尿酸生成過多或排泄減少,導(dǎo)致血清尿酸濃度升高的一種代謝性疾病。當(dāng)血清尿酸濃度高于正常范圍,處于超飽和狀態(tài)時,尿酸可以尿酸鹽的形式沉積在關(guān)節(jié)、軟骨或臟器中,導(dǎo)致痛風(fēng),甚至發(fā)生尿酸性腎病。高尿酸血癥與心血管疾病、高血壓、肥胖、高血脂等也存在廣泛的關(guān)聯(lián)性[2-3]。因此,有效控制高尿酸血癥具有重要臨床意義。臨床上常用別嘌呤醇、丙磺舒等藥物,通過抑制尿酸生成或促進(jìn)尿酸排泄,降低患者血清尿酸,進(jìn)而減少相關(guān)疾病的發(fā)病。然而,這些藥物對患者的胃腸道和腎臟均有一定的刺激性和不良反應(yīng)[4]。非布索坦雖然降尿酸作用顯著,但臨床試驗發(fā)現(xiàn)其有增加心源性死亡的風(fēng)險[5],因此,研發(fā)新型高效抗高尿酸血癥的一線治療藥物十分必要。龍膽苦苷是存在于龍膽GentianascabraBunge.、秦艽GentianamacrophyllaPall.等中藥中的環(huán)烯醚萜苷類化合物,具有多種藥理作用,比如對胃黏膜損傷有保護作用、對炎癥性腸病、膽汁淤積型肝炎和肝功能失常有預(yù)防和治療作用等[6]。秦艽提取物在腺嘌呤和乙胺丁醇誘導(dǎo)的高尿酸血癥模型中,龍膽苦苷在氧嗪酸鉀制備的高尿酸血癥模型中均可通過調(diào)節(jié)尿酸轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮降尿酸的作用[7-8]。本研究以果糖誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠模型,進(jìn)行龍膽苦苷降尿酸功效的評估,并考察其對肝臟尿酸生成關(guān)鍵酶-黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase,XOD)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康清潔級昆明種小鼠60只,雄性,4周齡,體質(zhì)量(20±3)g,西安交通大學(xué)實驗動物中心,動物合格證號:SCXK(陜)2017-003。在研究過程中,所有動物均在12 h光照-黑暗周期、溫度(22±2)℃和相對濕度(55±5)%的條件下飼養(yǎng)。動物飼養(yǎng)和實驗操作均符合西北大學(xué)動物福利和倫理原則,審查批準(zhǔn)編號:NWU-AWC-20181109M。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,狀態(tài)良好。

1.1.2 藥物 龍膽苦苷為自行提取分離制備,經(jīng)高效液相色譜測定,純度≥98.0%。別嘌呤醇(重慶科瑞制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H50020455)。果糖(德國MP公司,批號20180518)。

1.1.3 試劑與儀器 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic Pyruvic Transaminase,GPT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic Oxaloacetic Transaminase,GOT)檢測試劑盒(上海源葉生物科技有限公司,貨號:R21819,R21814);尿酸(Uric Acid,UA)、肌酐(Creatinine,Cr)和尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)檢測試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司,批號:180161,180481,180321);超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司,貨號:JYM0390Mo,JYM0345Mo);腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(Interleukin 6,IL-6)酶聯(lián)免疫吸附試驗(Elisa)試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司,貨號:JYM0218Mo,JYM0012Mo);XOD測定試劑盒(abcam公司,貨號ab102522);XOD抗體(abcam公司,貨號:ab133268);β-肌動蛋白(β-actin)(santa公司,貨號:sc-1616r)。全自動生化分析儀(美國Beckman coulter公司,型號:AU5800);離心機(上海雙旭電子有限公司,型號:TG16W);Western blot轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司,型號:1703930);電泳儀(北京六一儀器廠,型號:DYY-6C);一體式化學(xué)發(fā)光成像儀(上海勤翔科技有限公司,型號:ChemiScope 5300 Pro)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 動物隨機分為6組,正常對照組、模型組、別嘌呤醇組(5 mg/kg)、龍膽苦苷高、中、低劑量組(80 mg/kg、40 mg/kg、20 mg/kg),每組10只,正常對照組給予新鮮的飲用水,其余組給予10%果糖溶液(果糖溶于飲用水),每2天更換飲用水,持續(xù)8周誘發(fā)高尿酸血癥模型。

1.2.2 給藥方法 各給藥組動物每天上午9:00至11:00之間測量體質(zhì)量,按體質(zhì)量灌胃給藥,正常對照組和模型組灌服等體積生理鹽水,持續(xù)果糖喂養(yǎng)。喂養(yǎng)期間每天觀察小鼠的毛色,食量和死亡情況。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 標(biāo)本采集及處理 給藥干預(yù)4周,小鼠禁食12 h,末次給藥1 h后麻醉小鼠,眼球取血,靜置,離心得血清待做生化分析,摘取新鮮肝、腎組織,凍存、固定、檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3.2 血清生化指標(biāo)測定 取血清,于全自動生化分析儀檢測血清GPT、GOT、UA、Cr和BUN水平。

1.2.3.3 肝、腎組織病理學(xué)觀察 將肝、腎組織用4%的多聚甲醛固定24 h后,用石蠟包埋,切片(5 μm),置于干凈的載玻片上,以二甲苯脫蠟,梯度乙醇處理,蒸餾水洗,用蘇木精和伊紅染色后置顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.3.4 腎臟氧化應(yīng)激水平和炎癥介質(zhì)檢測 準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量腎組織,制成腎臟勻漿,嚴(yán)格按照Elisa試劑盒說明測定腎組織中SOD,MDA,TNF-α和IL-6水平。

1.2.3.5 肝臟XOD活性檢測 取小鼠肝臟組織于玻璃勻漿器中,按重量(g)∶體積(ml)=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水,冰水浴條件下,制備成10%的組織勻漿,12 000 r/min,離心15 min,離心半徑15 cm,取上清液,按照試劑盒說明書進(jìn)行XOD活力測定。

1.2.3.6 XOD蛋白表達(dá)水平檢測 取小鼠腎臟組織,加入裂解液后進(jìn)行勻漿,按BCA蛋白定量試劑盒說明書測定濃度,蛋白樣品經(jīng)12%凝膠分離后,轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluorie,PVDF)膜上。PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉后,加入相應(yīng)一抗,4 ℃孵育過夜,加入二抗孵育并顯影檢測。以β-Actin為內(nèi)參,采用ImageJ圖像分析系統(tǒng)分析蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 龍膽苦苷對果糖誘導(dǎo)高尿酸血癥小鼠體質(zhì)量和肝、腎功能的影響 與正常對照組比較,模型組小鼠體質(zhì)量,血清GPT、GOT、UA、Cr和BUN水平均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,給藥4周后,別嘌呤醇組和龍膽苦苷高、中劑量組小鼠體質(zhì)量顯著降低(P<0.05),別嘌呤醇組和龍膽苦苷高、中、低劑量組小鼠血清GPT、GOT、UA、Cr和BUN水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 龍膽苦苷對各組小鼠體質(zhì)量,血清GPT、GOT、UA、Cr和BUN水平的影響

2.2 龍膽苦苷對果糖誘導(dǎo)高尿酸血癥小鼠肝、腎組織病理形態(tài)的影響 正常對照組小鼠肝細(xì)胞大小均一,細(xì)胞核分布均勻,形態(tài)穩(wěn)定。與正常對照組小鼠比較,模型組小鼠肝組織中發(fā)現(xiàn)較多肝細(xì)胞空泡,判斷為脂肪空泡,同時有細(xì)胞核萎縮發(fā)生。與模型組比較,別嘌呤醇組和龍膽苦苷各劑量組以上病理特征改變得到明顯緩解,肝細(xì)胞空泡樣變性和細(xì)胞核萎縮的程度明顯減輕,小鼠大部分肝細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常。見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟組織病理變化(HE,×200)

正常對照組小鼠腎小球大小、形態(tài)正常,邊界清晰。腎小管內(nèi)部刷狀緣結(jié)構(gòu)完整,無明顯異常。與正常組比較,模型組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)紊亂,腎小球萎縮,腎小管管腔擴張。與模型組比較,別嘌呤醇組和龍膽苦苷各劑量組上述病理學(xué)改變明顯減輕。見圖2。

圖2 各組小鼠腎臟組織病理變化(HE,×200)

2.3 龍膽苦苷對果糖誘導(dǎo)高尿酸血癥小鼠腎臟SOD、MDA、TNF-α和IL-6水平的影響 與正常對照組比較,小鼠經(jīng)12周果糖喂養(yǎng),腎臟SOD水平顯著降低,MDA,TNF-α和IL-6水平均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,別嘌呤醇組和龍膽苦苷各劑量組SOD水平顯著升高(P<0.05或P<0.01),龍膽苦苷各劑量組MDA水平顯著降低(P<0.01),別嘌呤醇組和龍膽苦苷各劑量組TNF-α和IL-6水平均顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 龍膽苦苷對各組小鼠腎臟SOD,MDA,TNF-α和IL-6水平的影響

2.4 龍膽苦苷對肝臟XOD活性的影響 與正常對照組比較,模型組小鼠肝臟XOD活性顯著增加(P<0.01)。與模型組比較,給藥4周后,別嘌呤醇組和龍膽苦苷高、中、低劑量組肝臟XOD活性顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見圖3。

圖3 龍膽苦苷對各組小鼠肝臟XOD活性的影響

2.5 龍膽苦苷對肝臟XOD蛋白表達(dá)水平的影響 與正常對照組比較,模型組小鼠肝臟XOD表達(dá)顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,別嘌呤醇組和龍膽苦苷高、中、低劑量組肝臟XOD的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。見圖4。

圖4 各組小鼠肝臟XOD蛋白表達(dá)水平

3 討論

當(dāng)今社會高尿酸血癥和痛風(fēng)發(fā)病率逐年上升且呈現(xiàn)年輕化趨勢,其發(fā)病機制與不健康飲食密切相關(guān)[9-10]。含糖飲食,特別是高果糖玉米糖漿的生產(chǎn)及使用,使果糖攝入量大大增加,實驗和流行病學(xué)研究表明,長期高果糖飲食有引發(fā)高尿酸,導(dǎo)致腎小球硬化、腎臟功能障礙,以及肝臟脂肪堆積的風(fēng)險[11-12]。果糖喂養(yǎng)動物已成為被廣泛應(yīng)用的高尿酸血癥建模方法[13-14]。本實驗中,果糖連續(xù)喂養(yǎng)導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量顯著增加,UA水平顯著升高,血清肝功能損傷指標(biāo)GPT和GOT及腎功能損傷指標(biāo)Cr和BUN水平均顯著升高,小鼠肝細(xì)胞脂肪蓄積,腎小球萎縮、腎小管管腔擴張,說明本研究中的高尿酸小鼠造模成功。龍膽苦苷連續(xù)給藥4周后,血清中以上指標(biāo)的水平均顯著下降,肝、腎組織病理學(xué)改變明顯減輕。結(jié)果表明,龍膽苦苷可以保護果糖導(dǎo)致的肝、腎受損。

眾所周知,肝臟是果糖代謝的主要器官。高濃度果糖被實驗動物吸收,到達(dá)動物肝臟后,代謝需要消耗大量的ATP,高果糖攝入可促進(jìn)ATP向AMP的降解,因此也誘導(dǎo)嘌呤代謝相關(guān)酶的合成,包括XOD的大量合成,提升XOD活性,進(jìn)而增強嘌呤降解和肌苷的產(chǎn)生,促使更多嘌呤代謝終產(chǎn)物尿酸的產(chǎn)生[15-16]。存在于肝臟的XOD是嘌呤代謝途徑的限速酶,催化黃嘌呤生成尿酸,是調(diào)控尿酸生成的最終環(huán)節(jié),在高尿酸血癥的發(fā)病中占主導(dǎo)地位,抑制XOD的活性和表達(dá)可有效地減少尿酸的生成[17-18]。與已有的研究報道一致,小鼠經(jīng)果糖喂養(yǎng),肝臟XOD活性和表達(dá)水平明顯上升[16],本研究發(fā)現(xiàn),龍膽苦苷可顯著抑制XOD的活性和表達(dá),這些結(jié)果提示龍膽苦苷可通過抑制肝XOD的活性和表達(dá)減少尿酸的生成。

60%～75%的尿酸通過腎臟排泄,血尿酸升高,易使其停留于腎臟,誘導(dǎo)血管管壁發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),SOD是機體對抗自由基的酶促體系,保護機體免受氧自由基的損傷,可直接反映機體抗氧化能力[19],而MDA是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物,可以反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度,MDA的增加會加劇機體的氧化損傷。另外尿酸的停留,還可刺激單核細(xì)胞生成IL-1β、IL-6以及TNF-α,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),進(jìn)一步加重腎功能損傷,表現(xiàn)出血清Cr和BUN的升高[20-21]。本研究中龍膽苦苷可有效升高高尿酸小鼠腎臟SOD水平,抑制了尿酸引起的腎臟MDA、TNF-α及IL-6水平的增加,并使異常的Cr和BUN恢復(fù)正常水平,且其對Cr和BUN的降低作用優(yōu)于陽性對照物別嘌呤醇。據(jù)此推測,龍膽苦苷可通過早期干預(yù),降低血尿酸水平,并降低腎臟氧化應(yīng)激和炎癥水平,保護腎功能。

綜上所述,本研究證實了龍膽苦苷可有效降低血清GPT、GOT、UA、Cr和BUN水平,對肝腎具有保護作用,可減輕腎臟氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),并表明其降尿酸作用與抑制肝臟XOD的活性和表達(dá)相關(guān),作為潛在的天然降尿酸化合物應(yīng)進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明:無。