朱平川,岑衛(wèi)健,付強(qiáng),胡煒,盧潔

(1.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西大學(xué),廣西 南寧 530004;2.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣西 南寧 530004)

基于大腸桿菌蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定的陽(yáng)離子交換色譜優(yōu)化研究

朱平川1,岑衛(wèi)健1,付強(qiáng)1,胡煒1,盧潔2

(1.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西大學(xué),廣西 南寧 530004;2.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣西 南寧 530004)

以大腸桿菌蛋白質(zhì)的胰蛋白酶切產(chǎn)物為研究對(duì)象,對(duì)蛋白質(zhì)的提取效率進(jìn)行初步探討,重點(diǎn)是對(duì)多維色譜分離中常用的強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜的分離條件,包括緩沖液的種類、pH值,洗脫鹽的種類、有機(jī)溶劑的比例以及上樣量進(jìn)行了考察和比較.結(jié)果表明:功率為400 W,超聲時(shí)間為15 min,蛋白質(zhì)的提取效率達(dá)到最高.在強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜分離線性上樣量范圍內(nèi),10 mmol/L磷酸二氫鉀(pH=3.0)作為緩沖體系,在氯化鉀溶液作為洗脫鹽、流動(dòng)相中乙腈的體積分?jǐn)?shù)為30%的條件下進(jìn)行梯度洗脫時(shí),可獲得最佳的分離結(jié)果.

大腸桿菌蛋白質(zhì);蛋白提取;強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜;多肽分離

高通量和高分辨率的蛋白質(zhì)和肽段分離技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究的重要內(nèi)容.在“自下而上”的蛋白質(zhì)組學(xué)中,細(xì)胞與組織溶解物通過蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的肽類是非常復(fù)雜的混合物,多維色譜分離技術(shù)已經(jīng)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中獲得了廣泛的應(yīng)用[1-2],其中采用最廣泛的技術(shù)路線是離線/在線強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜(SCX)-反相色譜(RPLC)-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)的方法[3-4].即采用強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜和反相液相色譜兩種分離原理正交的分離方法構(gòu)成多維分離,在采用二維液相色譜結(jié)合生物質(zhì)譜對(duì)復(fù)雜生物樣品進(jìn)行分離分析過程中,反相液相色譜的分離條件比較成熟和確定,但強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜的分離條件依然有多種選擇,目前有很多學(xué)者對(duì)此方面進(jìn)行此方面的研究[5-8].

大腸桿菌做為一種模式菌,廣泛用于生物學(xué)研究領(lǐng)域,本文以未改造過的大腸桿菌蛋白為研究對(duì)象,對(duì)該蛋白質(zhì)的提取效率進(jìn)行初步探討,重點(diǎn)是對(duì)二維色譜分離中的第一維強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜分離條件進(jìn)行考察和優(yōu)化,期望得到最合適的分離條件,為后續(xù)開展的大規(guī)模蛋白質(zhì)鑒定提供前提條件.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑液相色譜儀(美國(guó)Waters公司),紫外分光光度計(jì)(美國(guó)PE公司),冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司),臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司),超純水儀(美國(guó)Millipore公司),數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),PolyLC SCX陽(yáng)離子交換柱100 mm×2.1 mm,5 μm,搖床(上海蘇坤有限公司),超聲波細(xì)胞破粹機(jī)(美國(guó)Sonics公司).

CHAPS、PMSF、丙烯酰胺等購(gòu)自Amresco公司,二硫蘇糖醇(DTT)、碳酸氫銨、氯化鈉、碘乙酰胺(IAA)、磷酸二氫鉀、胰蛋白酶、酵母提取物、氫氧化鈉均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,乙腈、四乙基溴化銨(TEAB)、三(2-羧乙基)膦(TCEP),購(gòu)自Thermo公司,所有使用水均使用Millipore過濾的超純水.

1.2樣品制備大腸桿菌全蛋白提取:吸取適量大腸桿菌(DH5α)于培養(yǎng)瓶在250 mL三角瓶中,裝入100 mL LB培養(yǎng)基,37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h.加入蛋白質(zhì)裂解液,間歇超聲.在4 ℃,以12 000 r/min離心15 min,取上清液,加入3倍體積-20 ℃預(yù)冷的丙酮,渦旋振蕩1 min,4 ℃沉淀過夜,以8 000 r/min離心15 min,取沉淀,使丙酮揮發(fā)完全,-80 ℃保存.

蛋白質(zhì)酶解:將蛋白溶解于100 μL 100 mmol/L TEAB中,用超純水調(diào)整總體積為200 μL,加入10 μL 200 mmol/LTCEP,55 ℃ 1 h孵育,另加入10 μL 375 mmol/L IAA,避光室溫孵化30 min,加入6倍體積的預(yù)冷丙酮,過夜沉淀,離心去丙酮,揮發(fā)10 min.上述蛋白質(zhì)加入200 μL 100 mmol/L TEAB復(fù)溶,按1∶20加入適當(dāng)?shù)囊让竷?chǔ)存液.37 ℃酶解過夜.

1.3色譜條件流動(dòng)相A為10 mmol/L磷酸二氫鉀中加入30%的乙腈(pH=3.0),流動(dòng)相B為10 mmol/L磷酸二氫鉀中加入100 mmol/L KCl(含30%的乙腈,且pH=3.0),洗脫梯度為:0～50 min,0～40%B;50～60 min,40%B～100%B;60～65 min,100%B～100%B;65～70 min,100%B～100%A;70～80 min,100%A.流速0.3 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm.

2 結(jié)果與討論

2.1超聲波功率和次數(shù)對(duì)全蛋白提取的影響蛋白質(zhì)因含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等氨基酸在280 nm處有最大紫外吸收.在一定濃度范圍內(nèi),蛋白質(zhì)含量與對(duì)應(yīng)的最大吸收波長(zhǎng)下的吸光值成正比.隨著菌體的破碎和體內(nèi)蛋白質(zhì)釋放,引起溶液A280的變化.因此,通過測(cè)定A280的變化,可間接反映大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)蛋白釋出情況[9].由圖1得到,在開始的10 min,功率為500 W的超聲效果最好,蛋白質(zhì)釋放率最高,但是隨著時(shí)間的增加,蛋白質(zhì)釋放率在緩緩下降,可能是蛋白質(zhì)發(fā)生了部分降解,而功率為400 W的超聲效果在15 min之前在慢慢上升,在15 min時(shí)蛋白質(zhì)釋放率達(dá)到圖1中的最高,綜合圖1分析,超聲波對(duì)蛋白質(zhì)提取最優(yōu)化的條件是:功率為400 W,超聲時(shí)間為15 min.

圖1 不同功率破碎蛋白質(zhì)釋出情況

2.2緩沖液溶液的確定在對(duì)多肽的檢測(cè)中,一般采用214 nm,多肽在更高波長(zhǎng)的區(qū)域吸光度普遍較低,流動(dòng)相范圍在pH≤3.5,6.0≤pH≤8.5或者pH≥11.0,磷酸鹽緩沖液都是不錯(cuò)的選擇[10],所以本實(shí)驗(yàn)中選擇10 mmol/L磷酸氫二鉀作為緩沖溶液.

圖2 流動(dòng)相pH=2.5,3.0,3.5,4.0時(shí)樣品的色譜分離圖

2.3溶液pH值的影響在考察溶液pH值對(duì)分離度的影響時(shí),配置緩沖液為流動(dòng)相A為10 mmol/L KH2PO4,流動(dòng)相B為10 mmol/L KH2PO4+0.1 mol/L KCl,兩相均用磷酸調(diào)節(jié)pH值為2.5、3.0、3.5、4.0,相應(yīng)在4種不同pH條件下對(duì)流動(dòng)相A和B分別加入30%(V/V)的乙腈,考察這4種pH條件下對(duì)分離度的影響(見圖2a～2d).

由于多肽具有不同的等電點(diǎn),因此可以通過調(diào)節(jié)不同的pH值使多肽帶有不同的電荷,從而與洗脫鹽之間發(fā)生強(qiáng)弱離子交換而被洗脫下來(lái).由結(jié)果可知,pH=3.5(圖2c)和pH=4.0(圖2d)時(shí)峰容量比較少,因?yàn)槟承┒嚯牡慕M成部分為天冬氨酸與谷氨酸等一些酸性氨基酸,它們的等電點(diǎn)值低于3.5,所以當(dāng)pH3.5和pH4.0時(shí),此類多肽帶負(fù)電荷,無(wú)法結(jié)合在色譜柱,而pH2.5(圖2a)時(shí),過低的pH值使多肽帶有很強(qiáng)的負(fù)電荷,牢固結(jié)合在色譜柱上,使得后面的鹽洗脫困難加大,所以大部分分離的肽段并未分布在洗脫過程中的0～40% B這段,而是集中在40% B～100% B這段,并且分離度不好.綜合以上分析,選擇pH=3.0(圖2b)作為溶液的pH值.

2.4洗脫鹽種類的影響在考察鹽的種類對(duì)分離度的影響時(shí),配置緩沖液為流動(dòng)相A、B均為10 mmol/L KH2PO4(pH 3.0)+30%(V/V)ACN,分別考察在流動(dòng)相B中加入0.1 mol/L氯化鉀、氯化銨、醋酸銨、氯化鈉對(duì)分離度的影響.根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[11]鹽的類型對(duì)蛋白及多肽保留行為的影響,可分為3種類型,強(qiáng)的頂替作用、弱的頂替作用和中間頂替作用.對(duì)于陽(yáng)離子交換色譜,流動(dòng)相中頂替離子的洗脫強(qiáng)度按以下順序減小:Zn2+>Mg2+>Mn2+>Ag+>Cs+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)中4種洗脫鹽中KCl的洗脫能力最強(qiáng),峰容量最大(見圖1),氯化銨與氯化鈉次之,而醋酸銨中含有羰基,在210 nm處附近有紫外吸收,所以影響檢測(cè)結(jié)果,而選擇醋酸銨作為洗脫鹽分離多肽混合物時(shí)常用于質(zhì)譜分析中.

2.5有機(jī)溶劑含量的影響在考察流動(dòng)相中乙腈的比例對(duì)分離度的影響時(shí),配置緩沖液為流動(dòng)相A為10 mmol/L KH2PO4(pH 3.0),流動(dòng)相B為10 mmol/L KH2PO4+0.1 mol/L KCl(pH 3.0),考察不同比例(10%、20%、30%和40%(V/V))乙腈對(duì)分離度的影響.對(duì)于強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜,肽段在色譜柱上的保留依賴于其與填料上離子基團(tuán)的靜電相互作用,但磺酰聚合物骨架又具有一定的疏水性,使得其與肽段會(huì)產(chǎn)生一定疏水相互作用而影響靜電相互作用[12].在使用強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜時(shí),適當(dāng)提高乙腈的比例以減少肽段與離子交換樹脂骨架間的疏水相互作用.因此,我們?cè)诹鲃?dòng)相的溶液中加入不同比例的乙腈,比較了乙腈比例不同的流動(dòng)相的分離效果.結(jié)果顯示:當(dāng)流動(dòng)相中乙腈比例為30%(V/V)時(shí),分離效果最好(見圖1).當(dāng)乙腈比例為10%、20%和40%時(shí)的峰容量都偏低.原因可能是乙腈比例偏低時(shí),一方面是大腸桿菌酶切樣品在流動(dòng)相A中不能完全溶解,因此未溶解部分的肽段便未能進(jìn)入分析柱;另一方面乙腈比例較低時(shí),肽段與骨架間的疏水相互作用不能得到有效抑制,從而會(huì)使部分肽段以疏水相互作用力保留在陽(yáng)離子色譜柱上,導(dǎo)致分離效果變差.而當(dāng)乙腈比例超過30%時(shí),一方面高比例的乙腈可能會(huì)使色譜柱填料性質(zhì)發(fā)生改變,從而影響分離效果;另一方面高比例的乙腈可能會(huì)使流動(dòng)相中的鹽析出,且不利于后續(xù)反相液相色譜的分離.所以在進(jìn)行強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜分離時(shí),有機(jī)相的比例控制在30%左右為宜.

2.6上樣量的影響任何一根色譜柱都有一個(gè)合適的進(jìn)樣線性范圍.當(dāng)樣品進(jìn)樣量很大時(shí),就會(huì)造成柱子超載的后果,峰寬增加、分離度降低,進(jìn)樣量太小會(huì)導(dǎo)致經(jīng)色譜分離后收集的餾分含量太低,從而影響質(zhì)譜的鑒定.對(duì)于多肽這類生物分子而言,成分復(fù)雜,出峰較多.在本文中,選擇復(fù)雜程度較高的大腸桿菌蛋白的胰蛋白酶酶切物為研究對(duì)象來(lái)測(cè)定線性色譜的上樣量范圍.實(shí)驗(yàn)中選取腸桿菌蛋白的酶切物分離中的一個(gè)色譜峰進(jìn)行觀察,當(dāng)上樣量從40 μg增加到400 μg時(shí),上樣量X(μg)與峰高Y(mV)呈較好的線性關(guān)系Y=1.562 5X+65.500,R2=0.997 8.考慮到樣品的消耗量,以及后續(xù)質(zhì)譜等一系列實(shí)驗(yàn),選擇進(jìn)樣量為80 μg作為實(shí)驗(yàn)的最佳上樣量.

3 結(jié)論

以大腸桿菌蛋白的胰蛋白酶酶切產(chǎn)物為研究對(duì)象,對(duì)蛋白質(zhì)的提取效率進(jìn)行初步探討,重點(diǎn)是對(duì)多維色譜分離中常用的強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜的分離條件(包括緩沖液的種類、pH值,洗脫鹽的種類、有機(jī)溶劑的比例以及上樣量)進(jìn)行了考察和比較.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在功率為400 W,超聲時(shí)間為15 min,蛋白質(zhì)的提取效率達(dá)到最高.在強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜分離線性上樣量范圍內(nèi),10 mmol/L磷酸二氫鉀(pH=3.0)作為緩沖體系,在氯化鉀溶液作為洗脫鹽,且流動(dòng)相中乙腈的體積分?jǐn)?shù)為30%條件下進(jìn)行梯度洗脫時(shí),可獲得最佳的分離結(jié)果.該結(jié)果并非在所有強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜柱上都通用,但仍具有一定的借鑒作用,旨在為分離復(fù)雜多肽混合物時(shí)選擇強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜作為一維分離時(shí)提供參考.

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(責(zé)任編輯 胡小洋)

OptimizationofconditionsfortheseparationwithstrongcationexchangechromatographybasedonEscherichiacoliproteinformassspectrometryidentification

ZHU Pingchuan1,CEN Weijian1,FU Qiang1,HU Wei1,LU Jie2

(1. State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources(Guangxi University), Nanning 530004, China; 2. School of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China)

As a research of tryptic digestion products fromEscherichiacoliprotein, on the extraction efficiency of protein were studied in this paper, The focus is on the separation conditions of strong cation used multidimensional chromatography exchange chromatography. The conditions included the buffer species, pH, the type of the salt in mobile phase, the proportion of organic solvent added in the elution solution, and the loading amount of the sample. The results showed that, in the power of 400 W, ultrasonic time was 15 minutes, achieved the highest extraction efficiency of protein. In the strong cation exchange chromatography separation of linear sample volume range, 10 mmol/L potassium dihydrogen phosphate(pH=3.0) of mobile phases and 30% (V/V) organic solvent in mobile phases as buffer system, as washing desalination in potassium chloride solution, can obtain the best separation results.

Escherichiacoliprotein; protein extraction; strong cation exchange chromatography; peptide separation

2014-02-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360459)和廣西大學(xué)科研基金項(xiàng)目(XJZ120280)資助

朱平川(1982-)女,,實(shí)驗(yàn)師;盧潔,通信作者,副教授,E-mail:13978884051@163.com

1000-2375(2014)05-0435-04

Q814

A

10.3969/j.issn.1000-2375.2014.05.009