王禮興　張均平　王明席等

[摘要] 目前普遍觀點認為，腫瘤產生的本質是細胞增殖的調節(jié)失控，而細胞的增殖要通過細胞周期來調控。細胞周期調控激酶復合物[cyclin dependent kinase（CDK）/Cyclin]活性的異常是導致細胞周期失控的根本原因。抑制CDK/Cyclin激酶的活性成為有效治療腫瘤的策略之一。因此，針對CDK/Cyclin激酶抑制劑的研究是當前抗腫瘤藥物開發(fā)的熱點之一。本文對近年來CDK/cyclin抑制劑的種類及目前其在臨床應用中出現的問題進行概述。

[關鍵詞] 細胞周期蛋白激酶抑制劑；腫瘤；細胞周期

[中圖分類號] R979.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）13-44-04

[Abstract] As normally accepted， the cell proliferation is regulated through cell cycle and the occurrence of tumor may lie in deregulation of cell cycle， directly resulted from the abnormal of the complex of cyclin dependent kinase（CDK）.It has become one of the most effective strategies to inhibit the activity of the complex for dealing with tumors.Thus，the study on CDK/Cylclin complex inhibitors is one of hot focuses in antitumor drug discovery.This thesis mainly discusses the types of CDK/Cyclin inhibitors and their clinical issues.

[Key words] Inhibitor；Cancer；Cell cycle

細胞周期的調控過程是在檢查點的監(jiān)視下，各種調控因子依次激活或滅活，從而啟動細胞完成DNA復制，分裂為2個子代細胞的過程。在諸多細胞周期調控因子中，細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）是處于核心位置，其與細胞周期蛋白Cyclins、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKIs）等組成細胞周期調控的網絡系統(tǒng)[1]。CDKs是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，目前有13種包括CDK1～13，分別在細胞周期調控CDKs（1～6）和轉錄調控CDKs（7～13）起作用。細胞周期的調控事實上就是檢查點的調控，其中以G1/S調控點最為重要。細胞周期受到外界信號如生長因子等刺激時，催化亞基CDK4/CDK6與調節(jié)亞基CyclinD結合后，CDKs殘基被磷酸化/去磷酸化修飾而被激活，CDKs激活后催化Rb蛋白使之磷酸化，Rb基因（retinob lastoma gene）又稱為視網膜母細胞瘤基因，是第一個被克隆的抑癌基因，其蛋白磷酸化后與轉錄因子（如E2F）形成復合物的能力喪失，E2F在細胞周期調控中起重要作用，能誘導CyclinE和CDK2的表達并形成CyclinE/CDK2復合體，后者進一步使Rb蛋白磷酸化，充分釋放E2F，隨后E2F進入核內激活一系列細胞周期進入S期的必須基因的表達。在S期內DNA復制晚期，CDK2被cyclinA激活，使轉錄因子E2F及時失活，阻止了由持續(xù)激活的E2F導致的細胞凋亡[2-3]。

1 CDK/Cyclin抑制劑的種類

研究統(tǒng)計顯示，有超過90%的人類癌癥中CDK、Cyclin、CKI和Rb途徑中相關基因發(fā)生了變異，其中CDK和其相應的調節(jié)亞基Cyclin的失常最為頻繁[2-3]。此外，細胞周期的波動促進了化療的抗性，降低了化療的效果。因此恢復細胞周期正常的CDK/Cyclin活性調控是治療腫瘤的策略之一。藥物研究人員已經把尋找不同類型CDK和Cyclin抑制劑作為前沿的抗腫瘤藥物的重點研究方向。目前CDK抑制劑主要有內源性的和外源性的兩種。

1.1 內源性小分子抑制劑

1.1.1 小分子量蛋白 內源性小分子抑制劑中最大的一類是低分子量蛋白質，根據結構功能的差異分為兩大類：一類稱雙重特異家族INK4，包括p15，p16，p18，p19，該蛋白家族可抑制cyclin D相關激酶的活性，其抑制作用依賴蛋白與相應的游離CDK4結合，從而阻斷CDK4與相應cyclin D結合形成具有催化功能的二聚體復合物。另一類叫Kip家族，包括p21，p27，p57，該蛋白家族可以和cyclin E/CDK2與cyclinA/CDK1組成的二聚體復合物再組成三聚體，通過封閉二聚體的催化活性中心從而發(fā)揮其抑制作用這些內源性抑制因子與激酶復合物結合后，可特異性地調節(jié)其活性，從而精確調節(jié)細胞由G1期向S期的轉化過程，內源性CDK調節(jié)劑的存在不僅提示細胞本身的分裂、增殖具有精密的調控機制，而且也反應了該信號轉導系統(tǒng)在細胞周期調控中的重要作用與地位[1-5]。研究表明，多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程與CDKs/cyclins的過度表達或其內源性抑制因子表達下降有關，如p16的缺失與小細胞和黑色素瘤、肺癌、乳腺癌和結直腸癌的發(fā)生密切聯(lián)系[4-7]；p27蛋白的缺失常見于乳癌，前列腺癌，結腸癌以及消化道腫瘤[8-12]。因此，內源性CDKs抑制因子的缺失或基因突變是腫瘤診斷的重要參考指標。

1.1.2 非編碼小RNA 內源性小分子抑制劑還有一類是近年來發(fā)現的一類重要的非編碼RNA——microRNA，MicroRNA是一種長度在21～23nt的非編碼RNA，通過與靶基因mRNA 3UTR區(qū)的靶位點區(qū)域相互結合而快速有效地降解mRNA或抑制蛋白的翻譯，將蛋白控制在生命活動所需的較低或最佳的水平上。已發(fā)現的參與細胞周期調控的microRNA已有10余種，其中miR-1-2與miR-34分別靶向CDK4，細胞周期被停滯于G1期，近而抑制腫瘤細胞增殖[13-15]；miR-22靶向CDK6細胞周期停滯于G1期，誘導乳腺癌細胞衰老。在不同的生物學過程中，這些miRNA通過靶向E2F、CDK、cyclin、p21、p27、DNA多聚酶α等促進或阻滯細胞周期的關鍵調節(jié)因子，進而調控細胞周期的進程。endprint

1.2 外源性小分子抑制劑

外源性的抑制劑包括反義核酸、抗體、小分子RNA干擾（siRNA）和小分子化合物四種。小分子化合物是最主要的一類外源性CDK抑制劑。

1.2.1 小分子化合物 近幾年來，由于對晶體結構的了解允許人們進行分子模擬研究，在設計開發(fā)高效、有選擇性的CDKs化學抑制劑的研究方面取得了突破性進展，可以說這類化合物每天都有新的成員在增加[15-17]。目前小分子CDK抑制劑可分為以下13類：（1）嘌呤類（Roscovitine and Olomoucin）、（2）嘧啶類（PD-033299）、（3）黃酮類（Flavopiridols）、（4）噻唑類（SNS-03）、（5）吲哚類及其衍生物（SU951）、（6）哌酮類（Paullones）、（7）咪唑并吡啶、吡唑并吡啶類（AZ703），（8）吡嗪類（AT751）、（9）丁酸內酯類（butyrolactone-1），（10）十字苞堿類（UCN-01）等13種，其中發(fā)展較快的為嘌呤類、嘧啶類、氨基噻唑類、黃酮類、吲哚咔唑類似物、Paullones、靛玉紅及其衍生物和吡嗪類。已有13個小分子抑制劑進入臨床實驗階段。它們都是平面雜環(huán)的小分子化學物，與ATP競爭性地結合在CDK激酶的ATP結合位點上。如Seliciclib[CYC202，（R）-roscovitine]是一個2，6，9-三元取代的嘌呤類似物，選擇性抑制CDKs/Cyclins，尤其是對CDK2/cyclinE的抑制作用最強。在體外對激酶活性的影響IC50值分別為CDK1/cyclinB（2.69μM）、CDK2/cyclinA（0.71μM）、CDK2/cyclinE（0.10μM）、CDK4/cyclinD1（14.21μM）、CDK7/cyclinH（0.49μM）、ERK-2（1.17μM）、PKA>50μM、PKC>100μM和SAPK>20μM。在體外，CYC202對多種人腫瘤細胞株的增殖有抑制作用，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌等。IC50值范圍是7.9～30.2μM，在24h，達到80%凋亡率時，CYC202濃度是20μM。對正常細胞的毒性明顯低于對癌細胞的毒性，IC50在22.2～100μM這個范圍。CYC202能抑制凋亡抑制基因的表達，通過抑制MDM2的表達，阻滯p53的降解，誘導腫瘤細胞周期停滯G1/S與G2/M期，降低pRb的磷酸化水平，誘導細胞周期各個時相的細胞凋亡。體內實驗表明，CYC202耐藥性好，口服生理活性良好，對由人結腸癌、子宮癌細胞接種裸鼠體內的實體瘤有明顯的抑制作用。CYC202正在進行2個Ib期劑量增加的臨床實驗，在Ib期研究中發(fā)現，10例患有卵巢癌的患者服用CYC2024個月以上，腫瘤沒有增加和嚴重的治療相關的副作用，其中1個患者的腫瘤縮小了30%以上，治療1年以上的患者病情穩(wěn)定。Ⅱ期臨床研究發(fā)現，CYC202單獨應用效果稍差，與其他化療藥物聯(lián)合應用治療效果顯著。CYC202聯(lián)合卡培他濱治療乳腺癌，聯(lián)合2，2-二氟脫氧胞嘧啶核苷或順鉑治療肺癌、鼻咽癌的IIb期臨床實驗也在進行[18-24]。

1.2.2 小分子RNA干擾 小分子RNA干擾技術的發(fā)展和應用，使特異性的干預靶分子的基因表達的研究成為可能，有不少科學家開始從基因水平干預CDK/Cyclin的合成。Lima等[25-26]將靶向CyclinE的siRNA轉染到肝癌細胞Hep3B、HepG2、SNU449（CyclinE過表達），HuH7（CyclinE沒有過表達）后發(fā)現，在過表達CyclinE的細胞中，CyclinE的表達下降了90%，DNA合成明顯下降，細胞發(fā)生凋亡。Galimberti等[27]將分別靶向CyclinE、CDK2、CDK1的siRNA轉染鼠肺癌細胞HOP-62、H-522、H-23后，發(fā)現CyclinE/CDK2能引起細胞凋亡，抑制肺癌細胞的增殖，而CDK1siRNA對細胞凋亡無影響。CDK1 siRNA干擾導致的CDK1表達降低只引起細胞期阻滯，細胞增殖減慢；而CDK1和CDK2 siRNA的共同干擾作用導致的CDK1、CDK2表達同時降低，引起細胞周期S期和G2/M期的阻滯，同時誘導了細胞的凋亡。曹銀芳等[28]成功將靶向CDK2/CyclinE的siRNA重組表達載體轉染肝癌HepG2細胞后，發(fā)現CDK2和CyclinE mRNA表達顯著下降，細胞周期停滯于S期發(fā)生阻滯，G1期細胞明顯增多，Caspase-3活性增強，HepG2細胞發(fā)生了凋亡，并且細胞周期的改變與轉染后HepG2細胞體外增殖力下降是一致的。

2 問題與展望

CDK1，CDK2，CDK4，CDK6是熱門的抗癌靶標，但由于激酶ATP結合位點高度的保守性，選擇性小分子抑制劑的設計與開發(fā)是一個公認的難題。因激酶結構的保守性而產生的耐藥性和毒副作用，嚴重阻斷了化療藥物的抗腫瘤效應，限制和影響了治療的效果。研究發(fā)現CDKs/Cylcins抑制劑的臨床應用出現的最大問題是腫瘤的耐藥性導致了腫瘤的復發(fā)，療效明顯降低。其抗性的產生與該致癌激酶基因的擴增、補充途徑及信號通路的反饋調節(jié)相關。此外，其抗性還與藥物靶點的單一或群體突變有關，導致了藥物與靶點的親和性差。

siRNA藥物誘導的RNAi具有特異性和高效性，是對成癮性致癌基因實施靶向治療的理想選擇。研究發(fā)現，化療藥物與siRNA聯(lián)合作用于腫瘤細胞，具有協(xié)同作用，基因治療可作為化學治療藥物外的補充途徑。Wang等[29]發(fā)現，用livin-siRNA表達載體轉染腫瘤細胞導致livin基因沉默后，可激活caspase-3并增加腫瘤細胞對紫外線等其他促凋亡刺激信號的敏感性。用RNAi技術下調bcl-2或XIAP基因表達，可增加人乳腺癌細胞MCF-7依托泊苷及阿霉素的敏感性，表現為腫瘤細胞的數量與活性下降、凋亡率增加，較單一化療藥物處理組活性細胞數目明顯減少。Chistiane等[30]將針對多藥耐藥基因MDR1編碼的P-gp-siRNA轉染人胰腺癌細胞EPP85-181RDB和人胃癌細胞EPG85-257RDB，發(fā)現上述細胞對柔紅霉素的耐藥性分別下降了89%和58%。具有MDR特性的K562細胞經上述siRNA處理后，也觀察到類似效果。因此，siRNA干擾技術可能是解決臨床上藥物抗性的主要手段之一。endprint

CDK及其相關蛋白表達異常與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關。不少外源性或者是內源性的CDK抑制劑在抑制CDK后，都能很好的抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。然而單獨CDK抑制劑治療，會有腫瘤逃逸的現象，而無法根治腫瘤。因此與其他治療手段聯(lián)合的治療方式，將是CDK抑制劑研究的方向之一。

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（收稿日期：2014-04-16）endprint