★ 王曉躍 鄧運(yùn)明 王力 陳浩 王明森 李華南 褚小剛

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 江西 南昌 330006)

人尿酸鹽陰離子蛋白1(hURAT1)是急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎及高尿酸血癥發(fā)病機(jī)制中的重要候選基因，國(guó)內(nèi)多項(xiàng)研究顯示，hURAT1啟動(dòng)子區(qū)SNP位點(diǎn)存在基因突變，與原發(fā)性高尿酸血癥及痛風(fēng)相關(guān)[1-3]。近些年來(lái)，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎及高尿酸血癥的發(fā)病率逐年升高。鑒于高尿酸血癥是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作期最主要的實(shí)驗(yàn)室表現(xiàn)，大約10%～20%高尿酸血癥可發(fā)展為痛風(fēng)，濕熱證型為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作期最主要的證型等因素，本研究擬通過(guò)對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎濕熱證型患者進(jìn)行hURAT1啟動(dòng)子區(qū)SNP測(cè)序，進(jìn)一步明確hURAT1啟動(dòng)子區(qū)SNP多態(tài)性與急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎濕熱證型的相關(guān)性，探究其可能的機(jī)制。

1 臨床資料

本研究中110例急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎病例全部來(lái)自江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診及住院部病人，且相互無(wú)血緣關(guān)系。經(jīng)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)臨床檢查確診，符合納入標(biāo)準(zhǔn)的，患者均自愿接受本課題研究治療。

入選正常對(duì)照組115例常人均來(lái)至江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心篩選的健康成人，經(jīng)全生化檢測(cè)、血壓測(cè)定及心電圖檢查等以排除冠心病、高血壓、糖尿病、高尿酸血癥、肝腎功能異常及家族病史者。

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：采用1977年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)制訂的痛風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)；中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)：主要采用國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》中的“痛風(fēng)的診斷依據(jù)、證候分類”標(biāo)準(zhǔn)中的“濕熱蘊(yùn)結(jié)”證型。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合上述西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡在18～65歲患者；(3)符合上述中醫(yī)辨證分型濕熱蘊(yùn)結(jié)證；(4)知情并同意接受實(shí)驗(yàn)方案。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)和納入標(biāo)準(zhǔn)者；(2)合并有心、肺、肝、凝血功能障礙等嚴(yán)重疾病者；(3)急、慢性腎衰竭、腎病綜合征、腎小管疾病等引起的繼發(fā)性高尿酸血癥患者；(4)有風(fēng)濕及類風(fēng)濕類疾病者。

2 材料和實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器 質(zhì)譜檢測(cè)儀(MassARRAY Analyzer Compact)；點(diǎn)樣儀(MassARRAY Samsung Nanodispenser)；384 孔雙頭 PCR 儀(GeneAmp?PCR System 9700 Dual 384-Well Sample Block Module)。

2.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Axygene96血基因組DNA小量制備試劑盒4×96；iPLEX反應(yīng)試劑；384-well SpectroCHIP生物芯片；HOTSTART taq酶；SAP酶；純化瓊脂。

2.3 外周抗凝血DNA的提取 GA組及CON組研究對(duì)象于清晨空腹抽取外周靜脈血，其中一部分ACD抗凝并置于-70℃保存，一部分離心取血清，運(yùn)用生化分析儀行測(cè)定尿酸、肌酐、尿素氮等指標(biāo)。取ACD抗凝血0.2mL，用美國(guó)Axygene公司Axygene96血基因組DNA小量制備試劑盒提取血基因組DNA。

2.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 依據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，運(yùn)用primer express5.0設(shè)計(jì)2對(duì)引物，擴(kuò)增hURAT1基因啟動(dòng)子區(qū)rs3825018。上游引物序列ACGTTGGATGATGCTGGAGGTCTCGGAATC，下游引物序列ACGTTGGATGTCTGCCTGCTGGTGTCACTT，擴(kuò)增長(zhǎng)度97bp，特異延伸引物TCTCGGAATCACCTCAC。

2.5 通過(guò)PCR擴(kuò)增，dNTp降解 SAP酶處理，降解擴(kuò)增用的dNTP，以確保延伸反應(yīng)只延伸一個(gè)堿基。延伸引物單堿基延伸反應(yīng)：配制iPlex反應(yīng)體系，加入到SAP處理后的384孔板中，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。最后樹脂除鹽純化。

2.6 Nanodispenser SpectroCHIP芯片點(diǎn)樣將檢測(cè)樣品從384孔反應(yīng)板轉(zhuǎn)移到表面覆蓋基質(zhì)的MassARRAY SpectroCHIP芯片。MassARRAY Analyzer Compac質(zhì)譜檢測(cè)將樣品轉(zhuǎn)移到SpectroCHIP芯片后，全自動(dòng)分析。TYPER4.0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，獲得分型數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎濕熱證型組與正常對(duì)照組臨床資料 見(jiàn)表1。

表1 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎濕熱證型組與正常對(duì)照組臨床資料對(duì)比

注：Age：年齡；SUA：血尿酸；BUN：尿素氮；CRE：血肌酐。

痛風(fēng)組110例與正常對(duì)照組115例在性別、年齡無(wú)顯著性差異(P>0.05)。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎組尿酸、尿素氮、血肌酐明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

鑒于男性女性在尿酸水平上診斷標(biāo)準(zhǔn)不同，本研究對(duì)男性、女性進(jìn)行分組比較，見(jiàn)表2。男性、女性急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎組與對(duì)照組在年齡分布上無(wú)明顯差異(P=0.20)。痛風(fēng)組男女比例為3.78∶1，痛風(fēng)組男性、女性尿酸均明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。痛風(fēng)組男性尿酸水平明顯高于女性尿酸水平(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。綜上，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎濕熱證型組患者血尿酸水平較高，并發(fā)生腎功能異常風(fēng)險(xiǎn)較高；男性較女性更易患急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，且男性患者血尿酸水平明顯高于女性。

3.2 人尿酸鹽陰離子蛋白1(hURAT1)單核苷酸多態(tài)性(SNP)測(cè)序分析結(jié)果 本研究對(duì)110例急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎濕熱證型患者與正常對(duì)照組患者配對(duì)行hURAT1基因SNP序列分析，在中國(guó)江西漢族人群hURAT1啟動(dòng)子區(qū)測(cè)序發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)，分別為rs3825018。

表2 男女性急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎濕熱證型組與正常對(duì)照組臨床資料對(duì)比

注：Age：年齡；SUA：血尿酸；BUN：尿素氮；CRE：血肌酐。

3.3 單核苷酸多態(tài)性(SNP)Hardy-Weinbery平衡檢驗(yàn)及連鎖分析 本研究對(duì)象均由江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診和住院部確診病人及體檢中心篩選出健康正常人，運(yùn)用Hardy-Weinbery平衡檢驗(yàn)研究人群是否符合隨即抽樣原則。在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎組及對(duì)照組中，4個(gè)SNPs基因型在225例研究對(duì)象中符合Hardy-Weinbery平衡分布(P>0.05)，符合選取研究對(duì)象隨機(jī)性的原則。

3.4 hURAT1啟動(dòng)子區(qū)基因rs3825018基因頻率 對(duì)hURAT1啟動(dòng)子區(qū)基因rs3825018 SNP基因型及等位基因頻率研究顯示，rs3825018雜合突變基因型(CT)、野生基因型(CC)、純和突變基因(TT)在對(duì)照組和痛風(fēng)組中的分布，分別為43.5%對(duì)27.3%，53.9%對(duì)70.0%，2.6%對(duì)2.7%，與野生基因相比，雜合突變基因型在兩組中分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)。SNP位點(diǎn)rs3825018突變等位基因T基因頻率為16.4%，低于對(duì)照組的24.3%(P=0.048)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表3。

表3 hURAT1啟動(dòng)子區(qū)基因rs3825018頻率的比較

3.5 Logistic回歸分析 通過(guò)對(duì)hURAT1啟動(dòng)子區(qū)中rs3825018 SNP位點(diǎn)進(jìn)行Logistic回歸分析，進(jìn)一步明確急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎濕熱證型的致病位點(diǎn)。Logistic回歸分析校正年齡和性別等因素后，結(jié)果顯示，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎濕熱證型組rs3825018突變型等位基因頻率低于對(duì)照組(P=0.048)，雜合突變基因型者患急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)較野生基因者降低(OR=0.483),提示hURAT1啟動(dòng)子區(qū)rs3825018 SNP位點(diǎn)中的突變性等位基因T為急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎濕熱證型的保護(hù)性等位基因。

3.6 結(jié)果 人尿酸鹽陰離子蛋白1(hURAT1)基因啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸多態(tài)性SNP位點(diǎn)rs3825018與急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎濕熱證型密切相關(guān)，其突變性等位基因T為急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎濕熱證型的保護(hù)性等位基因。

4 討論

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎在古籍中稱“歷節(jié)”、“白虎歷節(jié)”、“白虎風(fēng)”等名，屬中醫(yī)“痹證”范疇。中醫(yī)認(rèn)為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是脾虛失運(yùn)，濕濁內(nèi)阻。脾虛為本，濕濁為標(biāo)。若嗜食膏粱厚味、醇酒肥甘，或過(guò)度勞累、情志所傷，則進(jìn)一步內(nèi)耗正氣，損傷脾胃，使脾虛日益加劇、脾運(yùn)日趨減弱。久之濕濁為患，留滯體內(nèi)，流注骨節(jié)，氣血閉阻而作痛[4]。臨床分期各中醫(yī)證候構(gòu)成上，濕熱蘊(yùn)結(jié)證主要集中在急性期，痰濁阻滯證間歇期居多，瘀熱阻滯證、肝腎陰虛證則在慢性期居多。

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎其主要由于尿酸鈉在關(guān)節(jié)腔內(nèi)形成微晶體沉淀，引發(fā)非特異性關(guān)節(jié)炎癥。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎初期，因關(guān)節(jié)局部溫度較低、血尿酸水平升高、體液pH值減低及沉積晶體的脫落，大量尿酸鈉進(jìn)入關(guān)節(jié)腔。尿酸鈉與免疫球蛋白結(jié)合后被吞噬細(xì)胞吞噬，吞噬細(xì)胞在尿酸鈉的作用下，激活環(huán)氧酶和脂氧酶，使花生四烯酸轉(zhuǎn)化成前列腺素，以及各種致炎物質(zhì)的作用，使得炎癥進(jìn)一步發(fā)展[5]。

高尿酸血癥是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作期最主要的實(shí)驗(yàn)室表現(xiàn)，其主要是由于尿酸的排泄障礙所致。人機(jī)體內(nèi)尿酸存在腸道和腎臟兩個(gè)排泄途徑，其中腎臟排泄最為重要。尿酸在腎臟的排泄過(guò)程為：腎小球?yàn)V過(guò)，近端腎小管的重吸收，分泌與分泌后重吸收。正常情況下，血尿酸由腎小球?yàn)V過(guò)后90%經(jīng)近曲小管重吸收，再經(jīng)近曲小管遠(yuǎn)端分泌而排出體外。近年來(lái)隨著對(duì)腎尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的深入研究，人們?cè)诜肿铀缴蠈?duì)尿酸的排泄異常有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。腎臟中尿酸排泄異常的基因主要包括人尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(hURAT1)、人尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(hUAT)、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(OAT1)[6]、尿調(diào)節(jié)素基因(UMOD gene)。其中，huRAT1參與腎近端小管重吸收尿酸，是維持機(jī)體血尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵離子通道[7]。

人尿酸鹽陰離子交換器1(hURAT1)是參與尿酸鹽在腎近端小管重吸收重要的陰離子通道，對(duì)維持機(jī)體尿酸鹽動(dòng)態(tài)平衡起關(guān)鍵性作用。hURAT1基因突變或活性的改變均可能對(duì)腎臟尿酸排泄產(chǎn)生影響。基于這種假設(shè)，本研究通過(guò)病例研究，對(duì)hURAT1基因啟動(dòng)子區(qū)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測(cè)，研究其與急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎濕熱證型的相關(guān)性。

本研究對(duì)225例中國(guó)江西漢族人群hURAT1啟動(dòng)子區(qū)測(cè)序發(fā)現(xiàn)rs3825018 SNP位點(diǎn)，該SNP基因型在225例研究對(duì)象中符合Hardy-Weinbery平衡分布(P>0.05)，符合選取研究對(duì)象隨機(jī)性的原則。對(duì)其基因型及等位基因頻率研究顯示，rs3825018雜合突變基因型(CT)、野生基因型(CC)、純和突變基因(TT)在對(duì)照組和痛風(fēng)組中的分布，分別為43.5%對(duì)27.3%，53.9%對(duì)70.0%，2.6%對(duì)2.7%，與野生基因相比，雜合突變基因型在兩組中分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)。SNP位點(diǎn)rs3825018突變等位基因T基因頻率為16.4%，低于對(duì)照組的24.3%(P=0.048)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

近年來(lái)，已有歐洲、日本及國(guó)內(nèi)人群對(duì)hURAT1基因多態(tài)性與痛風(fēng)相關(guān)性研究的報(bào)道。Kozl M等[8]運(yùn)用meta分析對(duì)歐洲人群大規(guī)模血尿酸全基因組進(jìn)行關(guān)聯(lián)性研究，提示hURAT1與血尿酸水平密切相關(guān)(P=2.04×10-9)。Li[9]等通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)5'側(cè)翼區(qū)進(jìn)行功能檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)-253～+83為最小啟動(dòng)子功能區(qū)域，該區(qū)域存在多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)，提示該區(qū)域序列內(nèi)單個(gè)堿基突變，均可能影響基因轉(zhuǎn)錄的活性。本研究對(duì)225例中國(guó)江西漢族人群hURAT1基因SNP測(cè)序共發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNP位點(diǎn)，均在最小啟動(dòng)子區(qū)周圍，其可能是影響hURAT1基因轉(zhuǎn)錄活動(dòng)的多態(tài)性位點(diǎn)，最終影響機(jī)體血尿酸平衡，其最主要的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

[1]韓琳.人尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子(hURAT1)與原發(fā)性高尿酸血癥遺傳易感性研究[D].青島大學(xué),2008.

[2]孟曉梅.hURAT1基因啟動(dòng)子區(qū)+292C/G突變與高尿酸血癥的相關(guān)性研究[D].青島大學(xué),2009.

[3]于清.hURAT1基因啟動(dòng)子區(qū)-87C/T SNP與原發(fā)性痛風(fēng)的關(guān)聯(lián)及功能研究[D].青島大學(xué),2011.

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