★ 王敏 胡夢梅 陳文龍 盧傳禮 朱偉

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 廣東 廣州 510000)

土茯苓為百合科植物光葉菝葜(SmilarglabraRoxb.)的干燥根莖，其性味甘、淡、平，歸肝、胃經(jīng)，具有解毒，除濕，通利關(guān)節(jié)之功，可用于梅毒及汞中毒所致的肢體拘攣，筋骨疼痛；濕熱淋濁，帶下，癰腫，瘰疬，疥癬等疾病[1]?；瘜W(xué)成分研究表明，土茯苓根莖含有甾體皂甙、黃酮及黃酮甙類、苯丙素類、鞣質(zhì)等成分[2]。在各類成分中，黃酮類化合物被認(rèn)為是土茯苓中最重要的活性成分[3]。目前，在土茯苓總黃酮提取工藝研究方面，多采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[4,5]，其注重如何科學(xué)合理地安排實(shí)驗(yàn)，可同時(shí)考慮幾種因素，尋找最佳因素水平組合，但它不能在給出的整個(gè)區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確的函數(shù)表達(dá)式即回歸方程。

響應(yīng)面分析法(response surface methodology， RSM)是一種優(yōu)化多變量系統(tǒng)的有效試驗(yàn)工具，可采用多元二次回歸方程來擬合多個(gè)因素與響應(yīng)值之間、因素與因素之間的函數(shù)關(guān)系，找出各因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，有效地解決多變量問題。由于響應(yīng)面分析法在優(yōu)化研究中具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、精確度高、降低成本、提高產(chǎn)出、優(yōu)化加工條件、解決生產(chǎn)過程中實(shí)際問題等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于生物、化學(xué)、食品等領(lǐng)域[6,7]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，考察提取時(shí)間、乙醇濃度、提取溫度、料液比等提取條件之間交互作用對總黃酮提取率的影響，優(yōu)化土茯苓總黃酮的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料 土茯苓藥材購自康美中藥飲片(批號：12120527)，經(jīng)廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部陳燕芬主任中藥師鑒定為百合科光葉菝葜(SmilarglabraRoxb.)的干燥根莖，符合2010版《中國藥典》的規(guī)定。原料經(jīng)干燥，粉碎，過200目篩后得到均勻粉末，避光、干燥保存?zhèn)溆?。蘆丁(≥99%，成都曼斯特生物科技有限公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 總黃酮的提取 準(zhǔn)確稱取2 g土茯苓粉末置于大小適中的錐形瓶內(nèi)，按不同的料液比(1∶10～1∶60 g/mL)加入一定濃度的乙醇溶液(15～90%，v/v)，搖均，放置于一定溫度(25～75℃)的恒溫水浴中，提取一段時(shí)間(10～60 min)，4000 r/min離心20 min，取出上清液，按上述步驟重復(fù)2次，合并上清液，定容，4℃避光保存，待測。

1.3 總黃酮的含量測定 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系，以蘆丁為基準(zhǔn)，進(jìn)行總黃酮的含量測定[6]。

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取蘆丁對照品0.004 0 g，70%乙醇溶解，并定容至10 mL，搖均，得質(zhì)量濃度為400 μg·mL對照品溶液，4℃避光保存，備用。將對照品溶液用70%乙醇溶液稀釋成一系列濃度(0，25，50，100，150，200，400 μg/mL)溶液。分別取0.5 mL上述溶液加入0.075 mL亞硝酸鈉溶液(5%)，搖均，放置6 min；然后分別加入0.075 mL硝酸鋁溶液(10%)，搖勻，放置6 min；再分別加入1 mL氫氧化鈉溶液(4%)，搖均，放置10 min后，490 nm波長處測定吸光度值，每組反應(yīng)液平行3次。以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，以蘆丁質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.001 8X+0.037 3(r=0.999 7)，蘆丁在濃度25～400 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.3.2 樣品中總黃酮的提取率計(jì)算 取待測樣品溶液0.5 mL，用70%乙醇溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，按1.3.1節(jié)方法測定樣品的吸光度，按下式計(jì)算總黃酮的提取率：

1.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過單因素預(yù)試驗(yàn)，選擇提取時(shí)間、乙醇濃度、提取溫度、料液比4個(gè)因素，采用Design Expert 7.0.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件中Box-Behnken的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定土茯苓中總黃酮的最佳提取條件。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平的編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 各因素單獨(dú)對總黃酮提取率的影響

圖2 各因素單獨(dú)對總黃酮提取率的影響

單因素實(shí)驗(yàn)分別考察了提取時(shí)間、乙醇濃度、提取溫度以及料液比4個(gè)因素，以總黃酮提取率作為評價(jià)指標(biāo)，在確定其他參數(shù)不變的情況下改變其中一個(gè)參數(shù)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。從圖2A中可以看出總黃酮提取率隨著時(shí)間的增加而升高，藥材與溶劑接觸的時(shí)間延長有利于土茯苓中總黃酮的溶出；在20 min時(shí)提取率達(dá)到最大，隨后緩慢下降至平緩。圖2B表明提取溫度越高，土茯苓總黃酮提取率越好，其可能的原因在于溫度升高促進(jìn)了溶劑分子的熱運(yùn)動，同時(shí)降低了溶劑的黏性，更利于溶劑對于細(xì)胞壁的穿透性[5]，但溫度在65℃時(shí)提取率趨于平緩，故選取65℃為佳。由圖2C可見總黃酮提取率隨乙醇濃度升高而增加，當(dāng)乙醇濃度超過一定范圍時(shí)，提取率反而下降，這可能是由于黃酮易溶于中等或者中等偏上極性的溶劑中[9]，故選取55%為宜。圖2D結(jié)果表明，料液比增加，總黃酮提取率先上升后降低，當(dāng)料液比超過1∶20時(shí)，提取率增長速度降低趨于平緩，雖在1∶40處提取率達(dá)到最大，但考慮到若采用較大的料液比時(shí)，一方面增加了乙醇的用量，另一方面也增加了后續(xù)工藝的難度，最終導(dǎo)致生產(chǎn)成本的增加，故選擇1∶20為宜。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化工藝實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與回歸模型的建立 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以提取時(shí)間(X1)、乙醇濃度(X2)、提取溫度(X3)和料液比(X4)四個(gè)因素為自變量，總黃酮提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了共29個(gè)實(shí)驗(yàn)組的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)平行3次，試驗(yàn)方案和結(jié)果見表2。

2.2.2 建立模型回歸方程與顯著性檢驗(yàn) 利用Design Expert 7.0.0軟件對表2的結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸擬合，得到總黃酮提取率(Y)對提取時(shí)間(X1)、乙醇濃度(X2)、提取溫度(X3)、料液比(X4)的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=35.31+1.82X1+1.14X2+1.67X3+15.45X4+3.24X1X2+2.73X1X3+6.71X1X4+0.43X2X3+4.22X2X4+1.53X3X4-8.46X12-6.32X22-7.22X32-5.96X42

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

為考察上述回歸方程的有效性及各因素對提取率的影響程度，對上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可以看出模型極顯著(Prob>F值為0.009 1小于0.01)，而失擬項(xiàng)(Lack of Fit)不顯著(Prob>F值為0.132 2大于0.05)，說明該方程對試驗(yàn)擬合較好。單個(gè)因素X4和二次項(xiàng)X12對響應(yīng)值的影響顯著。

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化工藝分析 為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用，利用Design Expert 軟件模擬了影響因素對總響應(yīng)因子交互影響的3D響應(yīng)曲面圖(圖3)，將其中兩個(gè)因素固定在零水平，考察另外兩個(gè)因素之間的交互作用。從曲面圖和對應(yīng)的等高線的形狀可以直觀反映出兩自變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著[10,11]。

表3 響應(yīng)面分析法對總黃酮提取率的方差分析結(jié)果

圖3 各兩因素交互作用對總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖

由圖3可以看出料液比和提取時(shí)間 (3c)、乙醇濃度(3e)、提取溫度 (3f) 兩兩之間的交互作用非常顯著，表現(xiàn)為曲面較陡，等高線沿料液比方向變化較快，而沿其他因素方向變化較慢。在實(shí)驗(yàn)水平下，料液比對提取率的影響比提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度顯著[12]。圖3a顯示了提取時(shí)間和乙醇濃度對總黃酮提取率的影響。可以看出，隨著提取時(shí)間和乙醇濃度的同時(shí)增大，提取率呈先增大后降低的拋物線趨勢，其原因有可能與黃酮類物質(zhì)的極性大小和穩(wěn)定性有關(guān)[13]。但二者交互作用對提取率的影響不顯著。圖 3b 和3d與圖3a十分相似，等高線近似圓形，表明提取時(shí)間和提取溫度以及提取溫度和乙醇濃度交互作用對總黃酮提取率影響不顯著。

利用Design Expert 7.0.0軟件對回歸模型進(jìn)行進(jìn)一步的典型性分析，得到最優(yōu)提取工藝條件為：提取時(shí)間35.2 min、乙醇濃度：58.05%、提取溫度：68.7℃、料液比1∶30，總黃酮提取率理論值為49.931%。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為檢驗(yàn)響應(yīng)面分析法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行土茯苓總黃酮的提取實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際情況，將修正后的最優(yōu)提取條件定為：提取時(shí)間35min、乙醇濃度58%、提取溫度69℃、料液比1∶30，提取次數(shù)3次，共進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得到土茯苓總黃酮的平均提取率為49.003%，略低于理論值49.931%，其與理論預(yù)測值的相對誤差為1.89%，說明響應(yīng)面法設(shè)計(jì)準(zhǔn)確，模型可靠，不失為土茯苓總黃酮提取工藝優(yōu)化的一種有效方法。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化出土茯苓總黃酮提取工藝的最優(yōu)條件為：提取時(shí)間35.2 min、乙醇濃度：58.05%、提取溫度：68.7℃、料液比1∶30，提取次數(shù)3次。根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況修正上述條件后，總黃酮提取率為49.003%，與理論值49.931%相差不大，相對誤差為1.89%，表明響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的參數(shù)條件準(zhǔn)確可靠，可為土茯苓藥材的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供了實(shí)驗(yàn)參考和依據(jù)。

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