★ 陳俊杰 張馨瑜 諶燕 楊世林 范玫玫*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心 江西 南昌 330006;2.中國藥科大學(xué) 江蘇 南京 210009)

冠心舒為中草藥復(fù)方制劑，處方來源于中國藥典2005年版一部“冠心丹參膠囊”，通過應(yīng)用現(xiàn)代提取技術(shù)、精制純化技術(shù)，對處方中丹參、三七、降香三味藥材中有效部位的提取精制后，并通過藥效學(xué)篩選，制成的由丹參總酚酸、三七總皂苷、降香總萜三個有效組分組成的制劑，其有效成分的配比影響著藥物的療效。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 丹參總酚酸、三七總皂苷、降香油(本草天工制藥有限公司提供)。

1.2 實驗動物 清潔級Sprague-Dawley(SD)新生大鼠(1～3d)，雌雄不限(GCI公司提供)。

1.3 主要試劑 L-NAME、胰蛋白酶、Brdu、HEPES(均為Sigma公司產(chǎn)品)；MTT(Ameresco公司產(chǎn)品)；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(Beckman公司產(chǎn)品)；MDA、SOD、GPx、Catalase測定試劑盒(均為Beckman公司產(chǎn)品)；胎牛血清、MEM培養(yǎng)基(GIBCO BRL公司)；其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.4 方法 1.4.1 心肌細胞的分離培養(yǎng) 參照Spector等方法，取出生1～3d內(nèi)SD乳鼠心臟，分離心室組織，經(jīng)0.1%胰酶消化分離,用含15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基混懸后置CO2培養(yǎng)箱(5%CO2,37℃)培養(yǎng)2 h去除成纖維細胞,將懸浮的心肌細胞過200目不銹鋼網(wǎng),計算細胞懸液中臺盼藍拒染的活細胞數(shù),達90%以上。再分別按5×105/孔、1×105/孔接種于24孔培養(yǎng)板或96孔培養(yǎng)板內(nèi)，于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液，前3 d加入終濃度為0.1 mmol/LBrdu抑制纖維細胞生長。培養(yǎng)4 d隨機分組進行實驗。

1.4.2 心肌細胞A/R模型建立 心肌細胞生長接近融合狀態(tài)時，對培養(yǎng)心肌細胞換用模擬缺氧缺糖溶液，置于持續(xù)95%N2～5%CO2平衡的A/R裝置(37℃)中缺氧孵育3 h后，再換用模擬再灌注溶液于95%O2～5%CO2復(fù)氧孵育2 h。

1.4.3 冠心舒有效部位拆方實驗

1.4.3.1 按冠心舒分離所得的有效部位，根據(jù)原方的基本配比比例，設(shè)計了四因素四水平正交設(shè)計表(以人每次服用劑量計算，單位：g)，如表1～2所示。

表1 因素水平表

表2 四因素四水平設(shè)計方案表 /mg·L-1

1.4.3.2 實驗用培養(yǎng)4 d的心肌細胞，隨機分為以下18組(n=8)進行實驗，除上述16組外，還增設(shè)：(1)正常對照組(Control)：換正常培養(yǎng)液持續(xù)95%空氣～5%CO2，孵育5h；(2)A/R組：實驗時棄去原培養(yǎng)液，換模擬缺氧液，將培養(yǎng)板置于持續(xù)95%N2～5%CO2平衡的A/R裝置(37℃)中孵育3 h后，再換模擬再灌注液，以95%O2～5%CO2復(fù)氧孵育2 h(37℃)。1～16受試組：各孔分別加入含有終濃度為1%的DMSO以及相應(yīng)受試品處理的同時，進行A/R操作。

1.4.4 冠心舒有效部位最佳配比方案中，降香有效部位存在意義判斷 根據(jù)以上拆方實驗結(jié)果，選取效果最佳配比方案，除去有效部位之一,另取心肌細胞分組進行實驗(n=8)：實驗分組為：正常對照組(Control)、A/R組、1%的DMSO對照組，以及相應(yīng)處理組。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 細胞存活率 采用MTT比色法檢測；96板每孔加入MTT(5×10-3mg/L)20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入150μL DMSO，振蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔細胞的490 nm吸光值。設(shè)不含細胞、只加孵育液的空白對照，記錄結(jié)果。細胞存活率(%)=(各試驗組吸光值/對照組吸光值)×100%。

1.5.2 生化檢測 實驗結(jié)束后各組分別取孵育液200μL，Beckman生化自動分析儀測定LDH活性。用試劑盒測量SOD、Catalase、GPx活性以及MDA含量。

2 結(jié)果

2.1 冠心舒有效部位拆方結(jié)果 如表3所示：A/R組心肌細胞嚴(yán)重受損，細胞存活率、SOD、Catalase、GPx活性較Control組顯著降低，MDA含量顯著增加(P<0.01)；不同配比組合的冠心舒有效部位處理各組與A/R組相比細胞存活率、SOD、Catalase、GPx活性均有不同程度的升高，MDA含量也均有不同程度的降低(P<0.01或P<0.05)，表明冠心舒有效部位配比具有對抗心肌細胞的A/R的作用。經(jīng)方差分析以及組合判斷冠心舒有效部位的最佳配比組合為：丹參總酚酸2.7×10-2mg/L、三七總皂苷4.8×10-2mg/L、降香油2.625×10-3mg/L。

表3 冠心舒有效部位拆方實驗結(jié)果±s，n=8)

2.2 冠心舒有效部位最佳配比方案中，降香有效部位存在意義的判斷。 圖1～6所示：當(dāng)在冠心舒有效部位最佳配比方案中，除去三個有效部位其中之一，冠心舒有效部位對抗心肌細胞的A/R的作用顯著減弱，尤其以反映細胞抗脂質(zhì)氧化狀態(tài)指標(biāo)SOD、Catalase、GPx活性以及MDA含量更為明顯。

圖1 有效部位配比對心肌細胞存活率的影響

圖2 有效部位配比對LDH的影響

圖3 有效部位配比對SOD的影響

圖4 有效部位配比對Catalase的影響

圖5 有效部位配比對GPx的影響

圖6 有效部位配比對MDA的影響

3 小結(jié)

冠心舒有效部位配比組合具有對抗心肌細胞的A/R的作用，其最佳配比組合為：丹參總酚酸2.7×10-2mg/L、三七總皂苷4.8×10-2mg/L、降香油2.625×10-3mg/L。

當(dāng)在冠心舒有效部位最佳配比組合方案中，分別除去三者中任何一味，冠心舒有效部位對抗心肌細胞的A/R的作用顯著減弱，尤其以反映細胞抗脂質(zhì)氧化狀態(tài)指標(biāo)SOD、Catalase、GPx活性以及MDA含量更為明顯。