管一春，楊雪峰，王興玲，孫麗君，張彩霞，李巍巍，婁 華,李 麗

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院超聲科 鄭州 450052

睪酮對(duì)子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞LIF、HOXA10蛋白表達(dá)的影響*

管一春1)，楊雪峰2)#，王興玲1)，孫麗君1)，張彩霞1)，李巍巍1)，婁 華1),李 麗3)

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院超聲科 鄭州 450052

#通訊作者，女，1956年5月生，教授，主任醫(yī)師，研究方向：生殖內(nèi)分泌及宮頸疾病，E-mail：yxfeng@zzu.edu.cn

多囊卵巢綜合征；白血病抑制因子；同源框基因A10;Ishikawa細(xì)胞；睪酮

目的：探討睪酮對(duì)子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細(xì)胞白血病抑制因子(LIF)和同源框基因(HOXA10)表達(dá)的影響。方法培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞，分別加入終濃度為0(對(duì)照)、10-8、10-6、10-4mol/L的睪酮溶液，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)24和48 h后Ishikawa細(xì)胞LIF和HOXA10蛋白的表達(dá)。結(jié)果睪酮呈時(shí)間和濃度依賴性地性抑制Ishikawa細(xì)胞LIF和HOXA10的表達(dá)(LIF:F組間=19.205,F時(shí)間=32.745,F交互=37.379，P均<0.001。HOXA10:F組間=27.703，F(xiàn)時(shí)間=15.379，F(xiàn)交互=22.021，P均<0.001)。結(jié)論高雄激素血癥可能是影響多囊卵巢綜合征子宮內(nèi)膜容受性的因素之一。

多囊卵巢綜合征(polycysticovariansyndrome，PCOS)是目前排卵障礙性不孕癥較為常見(jiàn)的原因之一，高雄激素血癥(hyperandrogenemia,HA)是其最重要的特征之一。對(duì)PCOS患者采用促排卵等措施促使卵泡發(fā)育成熟并排卵后，其妊娠率仍徘徊在較低的水平，且流產(chǎn)率很高，提示可能還存在子宮內(nèi)膜環(huán)境不良的因素。近年來(lái)關(guān)于子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)記物的研究已經(jīng)成為不孕癥研究的焦點(diǎn)。白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)是子宮內(nèi)膜容受性公認(rèn)的標(biāo)志物，常用于判斷種植窗口期內(nèi)膜允許胚泡黏附、植入的容受性。同源框基因(homeoboxgene，HOX)是一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。近年來(lái)研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，HOXA10在子宮內(nèi)膜的增生與分化、容受性建立、胚胎著床和子宮內(nèi)膜蛻膜化等過(guò)程中不可或缺。被很多學(xué)者用作衡量子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志物。研究[3]證實(shí)子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞Ishikawa細(xì)胞株是研究子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞調(diào)節(jié)因素的良好模型。作者采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)睪酮作用后Ishikawa細(xì)胞中LIF和HOXA10蛋白表達(dá)的變化，探討PCOS患者子宮內(nèi)膜容受性的影響因素，為進(jìn)一步尋找促排卵治療后不良妊娠結(jié)局的原因提供線索。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑Ishikawa細(xì)胞由北京大學(xué)附屬人民醫(yī)院婦產(chǎn)科魏麗慧、王建六教授惠贈(zèng)，屬于貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞，來(lái)自人高分化子宮內(nèi)膜腺癌組織，經(jīng)分化培養(yǎng)可穩(wěn)定傳代，已證實(shí)該細(xì)胞株可以表達(dá)雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和睪酮受體(TR)。睪酮(粉劑)為美國(guó)Biologieal公司產(chǎn)品，羊抗人LIF和HOXA10多克隆抗體為美國(guó)SantaCruz公司產(chǎn)品，RPMI1640培養(yǎng)基為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，免疫細(xì)胞化學(xué)SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2細(xì)胞復(fù)蘇、消化與培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞于液氮中儲(chǔ)存，使用時(shí)隨時(shí)復(fù)蘇。將凍存細(xì)胞迅速放進(jìn)37 ℃的溫水中，并不停攪動(dòng)，解凍后吸出細(xì)胞懸液放入15mL離心管中，500r/min離心6min,吸棄上清液，沉淀中加入4mL含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的完全培養(yǎng)液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳5代后將舊培養(yǎng)液倒出后，加入Hanks液，輕輕吹打瓶壁上的細(xì)胞，加入消化液使其覆蓋在整個(gè)細(xì)胞表面；顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓且其中間隙變大時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，加入含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的完全培養(yǎng)液3～5mL；反復(fù)吹打細(xì)胞，混勻后制成細(xì)胞懸液；將其分裝到3～5個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)液5mL后密封，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況更換培養(yǎng)基，一般更換頻率為1 次/d; 細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合度時(shí)(一般2～3d)，丟棄培養(yǎng)基并用生理鹽水洗2次，加入2.5g/L胰蛋白酶消化液消化。

1.3實(shí)驗(yàn)分組依據(jù)以上方法培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105mL-1，接種于24孔培養(yǎng)板(預(yù)先裝有無(wú)菌蓋玻片)中，分別加入終濃度為0(對(duì)照)、10-8、10-6、10-4mol/L的睪酮溶液[3]，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞爬片(接種于24孔板的蓋玻片)分別培養(yǎng)24和48h后取出。

1.4LIF和HOXA10蛋白的檢測(cè)采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法。將取出的細(xì)胞爬片置純丙酮中固定30min。PBS清洗，體積分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白封閉。滴加稀釋50倍的羊抗人LIF/HOXA10多克隆抗體;PBS清洗，滴加生物素標(biāo)記的二抗;PBS清洗。DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹(shù)膠封片。光鏡下觀察，LIF和HOXA10以細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，以試劑公司提供的已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。選取5個(gè)高倍鏡視野，使用Powersite顯微圖像采集系統(tǒng)分析，以陽(yáng)性區(qū)的平均灰度值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0進(jìn)行分析。應(yīng)用2×4析因設(shè)計(jì)的方差分析比較不同濃度睪酮作用不同時(shí)間后Ishikawa細(xì)胞中LIF和HOXA10蛋白表達(dá)的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

各組Ishikawa細(xì)胞中LIF和HOXA10蛋白的表達(dá)見(jiàn)圖1和表1。

圖1 各組Ishikawa細(xì)胞中LIF(1)和HOXA10(2)蛋白的表達(dá)(SP,×400)

A,B,C,D：作用24 h；E，F(xiàn)，G，H：作用48 h；A，E：0 mol/L睪酮；B，F(xiàn)：10-8mol/L睪酮；C，G：10-6mol/L睪酮；D，H：10-4mol/L睪酮。

表1 各組Ishikawa細(xì)胞中LIF和HOXA10蛋白的表達(dá)

LIF:F組間=19.205,P<0.001；F時(shí)間=32.745，P<0.001；F交互=37.379，P<0.001。HOXA10:F組間=27.703,P<0.001；F時(shí)間=15.379，P<0.001；F交互=22.021，P<0.001。

3 討論

國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者認(rèn)為，人體內(nèi)正常范圍內(nèi)的雄激素在維持胚胎著床過(guò)程中子宮內(nèi)膜微環(huán)境的穩(wěn)定方面起著調(diào)節(jié)的作用[3]。PCOS患者異常的內(nèi)分泌環(huán)境，不僅能影響卵泡的發(fā)育，對(duì)子宮內(nèi)膜形態(tài)和功能也有一定的影響。并且高雄激素可以造成卵泡發(fā)育不良或者不排卵，致使黃體功能不全，進(jìn)而降低妊娠率，增加流產(chǎn)的發(fā)生，還可直接影響子宮內(nèi)膜的容受性。研究[4-5]表明雄激素通過(guò)雄激素受體(AR)產(chǎn)生過(guò)量的復(fù)合物，直接作用于子宮內(nèi)膜，降低子宮內(nèi)膜的容受性，進(jìn)而影響妊娠結(jié)局。

Tuckerman等[6]認(rèn)為雄烯二酮?jiǎng)┛捎绊憙?nèi)膜容受因子的分泌。文獻(xiàn)[7-9]表明Ishikawa細(xì)胞是一種源自腺上皮分化良好的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，具有功能活性ER、PR和AR，是研究子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞因子及其功能的理想模型。作者通過(guò)模擬PCOS患者高雄激素的內(nèi)分泌狀態(tài)，得出睪酮呈濃度和時(shí)間依賴性地抑制Ishikawa細(xì)胞中LIF和HOXA10的表達(dá)，進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜的容受性。

總之，在臨床上對(duì)PCOS不孕癥患者的治療中，僅僅通過(guò)促排卵藥物促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)，然后再通過(guò)藥物誘導(dǎo)排卵的妊娠結(jié)局是不理想的。還需要采取措施改善內(nèi)膜容受性。而降低體內(nèi)雄激素水平，可能會(huì)改善子宮內(nèi)膜容受性，改善促排卵治療后妊娠結(jié)局。

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(2013-10-09收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

Effect of testosterone on expressions of leukemia inhibitor factor and Homeobox gene A10 in endometrial adenocarcinoma cell

GUANYichun1),YANGXuefeng2),WANGXingling1),SUNLijun1),ZHANGCaixia1),LIWeiwei1),LOUHua1),LILi3)

1)DepartmentofReproductionCenter,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofObstetricsandGynecology,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 3)DepartmentofUltrasonography,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

polycystic ovary syndrome；leukemia inhibitor factor；homeobox gene A10；Ishikawa cell;testosterone

Aim: To observe the effect of testosterone on expressions of the leukemia inhibitor factor(LIF) and homeobox gene(HOX) A10 in human endometrial adenocarcinoma cell line (Ishikawa). Methods: Ishikawa cells were treated with 0(control),10-8,10-6,10-4mol/L testosterone. After 24 and 48 h，the expressions of LIF and HOXA10 protein were detected by immunocytochemical technique. Results: Testosterone inhibited the expressions of LIF and HOXA10 in a time- and concentration- dependent manner(LIF:Fgroup=19.205，F(xiàn)time=32.745，F(xiàn)interaction=37.379，allP<0.001;HOXA10：Fgroup=27.703,Ftime=15.379,Finteraction=22.021，allP<0.001).Conclusion:HyperandrogenemiamaycauselowendometrialreceptivityinpatientwithPCOS.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.022

*河南省衛(wèi)生廳科技攻關(guān)項(xiàng)目 2011020054

R711.7