金小小，張淑玲，徐黎娟，范洪領(lǐng)，鐘志超，李 曦，常全忠#

1)遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生理學(xué)教研室 珠海 519041 2)遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)兒科學(xué)教研室 珠海 519041 3)莆田市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科 莆田 351100

ClC-3在SIN-1誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡中的作用*

金小小1)，張淑玲2)，徐黎娟3)，范洪領(lǐng)1)，鐘志超1)，李 曦1)，常全忠1)#

1)遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生理學(xué)教研室 珠海 519041 2)遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)兒科學(xué)教研室 珠海 519041 3)莆田市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科 莆田 351100

#通訊作者，男，1965年5月生，博士，教授，研究方向：缺血性腦損傷及其保護(hù)機(jī)制，E-mail：cqzchang@sina.com

ClC-3氯通道；3-嗎啡斯得酮胺；海馬神經(jīng)元；細(xì)胞凋亡；4,4’-二異硫氰基芪-2,2’-二磺酸

目的：探討ClC-3氯通道在NO供體SIN-1誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡中的作用。方法取離體培養(yǎng)12 d的SD大鼠海馬神經(jīng)元，分為對(duì)照組、SIN-1組和SIN-1+DIDS組。對(duì)照組不作處理，SIN-1組加入終濃度為0.5 mmol/L SIN-1作用18 h,SIN-1+DIDS組加入終濃度為0.5 mmol/L SIN-1和0.1 mmol/L DIDS作用18 h。采用細(xì)胞免疫熒光染色和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)各組ClC-3氯通道蛋白的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)各組ClC-3氯通道 mRNA的表達(dá)。結(jié)果各組Caspase-3和ClC-3氯通道表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(蛋白：FCaspase-3=118.330，P<0.001；FClC-3氯通道=102.750，P<0.001;mRNA:FClC-3氯通道=32.955，P<0.001)。SIN-1誘導(dǎo)凋亡神經(jīng)元ClC-3氯通道蛋白表達(dá)增強(qiáng)，氯通道阻斷劑DIDS削弱ClC-3氯通道的表達(dá)。結(jié)論ClC-3氯通道可能參與SIN-1誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡。

腦卒中是常見的腦血管疾病，缺血性腦損傷引起者多見，而神經(jīng)元的凋亡直接影響到缺血性腦損傷的預(yù)后[1]。目前，缺血性腦損傷神經(jīng)元凋亡的機(jī)制尚未闡明。近年來氯通道在缺血性腦損傷中的作用成為關(guān)注的熱點(diǎn)[2-3]。研究[4]顯示, 氯通道的激活所引起的心肌細(xì)胞容積減少在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用，推測(cè)這種氯通道可能是ClC-3。作者[5]前期的研究結(jié)果提示ClC-3在缺血性腦損傷海馬神經(jīng)元凋亡中可能有一定的作用。該研究利用NO供體3-嗎啡斯得酮胺(SIN-1)誘導(dǎo)離體大鼠海馬神經(jīng)元損傷,通過細(xì)胞免疫熒光染色、Western blot和實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)檢測(cè)ClC-3在神經(jīng)元損傷過程中表達(dá)的變化,探討ClC-3活動(dòng)與缺氧敏感性神經(jīng)元凋亡的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑新生1 d的SD大鼠，由遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；DMEM/F12和Neurobasal培養(yǎng)基、B27(美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品)；SIN-1、氯通道阻斷劑4,4’-二異硫氰基芪-2,2’-二磺酸(DIDS)、ClC-3蛋白抗體、多聚賴氨酸、阿糖胞苷、DMEM/F12和Neurobasal培養(yǎng)液等試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清(杭州四季青公司產(chǎn)品)。

1.2離體海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[5-6]方法，取出生1 d的SD大鼠，雌雄不拘，無菌斷頭取腦，分離雙側(cè)海馬并將其剪碎，2.5 g/L胰蛋白酶37 ℃消化15 min，加入DMEM/F12培養(yǎng)液并吹打均勻，200目篩網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入DMEM/F12培養(yǎng)液(含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、0.2 mol/L谷氨酰胺和1 U/mL青、鏈霉素)，吹打混勻后接種在培養(yǎng)板內(nèi)，置于含有體積分?jǐn)?shù)95%空氣和5%CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48 h后更換為Neurobasal培養(yǎng)液，加入1×10-5mol/L阿糖胞苷作用48 h。每周更換培養(yǎng)基2次，每次更換原液體的1/3。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理取培養(yǎng)12 d的神經(jīng)元加入24孔板，隨機(jī)分為對(duì)照組、SIN-1組和SIN-1+DIDS組。對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，SIN-1組加入終濃度為0.5 mmol/L SIN-1作用18 h,SIN-1+DIDS組加入終濃度為0.5 mmol/L SIN-1和0.1 mmol/L DIDS作用18 h。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.4ClC-3蛋白的免疫熒光染色檢測(cè)取各組細(xì)胞，0.1 mol/L PBS漂洗，40 g/L多聚甲醛固定30 min， 0.1 mol/L PBS漂洗，正常山羊血清封閉1 h，加入ClC-3抗體(稀釋1 000倍)，4 ℃過夜，0.1 mol/L PBS 漂洗后多聚甲醛固定15 min，經(jīng)0.1 mol/L PBS 漂洗，山羊血清封閉1 h，NeuN抗體(稀釋1 000倍)，4 ℃過夜，0.1 mol/L PBS漂洗，多聚甲醛固定30 min，加入二抗羊抗兔IgG(稀釋2 000倍)、羊抗小鼠IgG(稀釋2 000倍)作用1 h，0.1 mol/L PBS漂洗，多聚甲醛固定15 min， PBS漂洗后倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.5ClC-3和Caspase-3蛋白的Westernblot檢測(cè)

取各組細(xì)胞，用冰冷0.1 mol/L PBS洗滌后每孔加200 μL細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，BAC法測(cè)定蛋白含量并調(diào)節(jié)蛋白濃度。加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸10 min使蛋白變性，SDS-PAGE電泳，NC膜轉(zhuǎn)移，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗Caspase-3多克隆抗體或ClC-3抗體(400倍稀釋)，4 ℃過夜，TBST緩沖液漂洗后加入HRP標(biāo)記的二抗(2 000倍稀釋) 37 ℃孵育1 h，TBST緩沖液漂洗5×5 min，ECL顯影。以目的蛋白條帶與β-actin條帶灰度值比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6ClC-3mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)ClC-3上游引物:5’-CTACTACCACCACGACTG-3’，下游引物:5’ -TTGTCACACCACCTAAGC-3’，擴(kuò)增片段大小116 bp；GAPDH上游引物:5’-CTCCCATT CCTCCACCTTTG-3’，下游引物:5’-CCACCACCCTGT TGCTGTAG-3’，擴(kuò)增片段大小110 bp。參照文獻(xiàn)[7]提取各組神經(jīng)元總RNA，用1.0 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性后進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，染料法(SYBR Green I) 進(jìn)行相對(duì)定量分析。反應(yīng)條件：93 ℃預(yù)變性2 min，93 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行融解曲線分析。利用ABI PRISM 7000 Sequence Detection System圖像分析系統(tǒng)，采用2-ΔΔCt進(jìn)行相對(duì)定量分析，以GAPDH作為內(nèi)參基因。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0分析，采用單因素方差和SNK-q檢驗(yàn)分析比較各組Caspase-3和ClC-3的表達(dá)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1ClC-3蛋白的免疫熒光染色結(jié)果SIN-1誘導(dǎo)海馬凋亡神經(jīng)元ClC-3蛋白表達(dá)增強(qiáng)，氯通道阻斷劑DIDS削弱了ClC-3蛋白的表達(dá)(圖1)。

圖1 各組ClC-3蛋白的免疫熒光染色結(jié)果(×400)

2.2各組Caspase-3和ClC-3蛋白表達(dá)的Westernblot結(jié)果見圖2和表1。

2.3ClC-3mRNA表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果見表1。

圖2 各組Caspase-3(上)和ClC-3(下)蛋白的Western blot 結(jié)果

表1 各組Caspase-3和ClC-3表達(dá)的比較

*:與對(duì)照組比較，P<0.001;#：與SIN-1 組比較，P<0.001。

3 討論

ClC-3為ClC型氯通道的家族成員之一,相對(duì)分子質(zhì)量為84 000，廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞，在大鼠的海馬、嗅球和小腦神經(jīng)細(xì)胞上大量表達(dá)，參與細(xì)胞的多種生理功能[8-9]。氯通道在細(xì)胞凋亡中的重要作用逐漸引起重視。有學(xué)者[10]認(rèn)為氯通道可能參與STS誘導(dǎo)的離體小鼠心肌細(xì)胞缺血性凋亡。氯通道阻斷劑NPPB可通過抑制H2O2激活的氯電流，阻滯細(xì)胞凋亡容積減少，從而防止PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡。氯通道也參與了腫瘤細(xì)胞的凋亡[11]。

NO的過量產(chǎn)生是缺血性腦損傷后神經(jīng)元凋亡的機(jī)制之一，而生理濃度的NO不會(huì)損傷神經(jīng)元[12-13]。作者模擬缺血性腦損傷神經(jīng)元凋亡的機(jī)制，選用NO供體誘導(dǎo)離體神經(jīng)元損傷。SIN-1是一種常用的誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的NO供體，在水溶液中能產(chǎn)生大量的NO，后者可與O2結(jié)合生成自由基。根據(jù)文獻(xiàn)[14]，作者選擇0.5 mmol/L SIN-1用于離體海馬神經(jīng)元凋亡的誘導(dǎo)。SIN-1 誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷后ClC-3蛋白和mR NA表達(dá)水平增強(qiáng)，而氯通道阻滯劑DIDS能削弱SIN-1誘導(dǎo)的ClC-3的表達(dá)。該研究結(jié)果提示ClC-3的活動(dòng)與離體海馬神經(jīng)元凋亡之間有一定關(guān)系，ClC-3可能參與了SIN-1誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡。

ClC-3活動(dòng)增強(qiáng)引起神經(jīng)元凋亡的機(jī)制尚不清楚。資料[3,15]顯示，ClC-3 氯通道具有外向整流特性并具有容積敏感性，氯通道阻斷劑SITS和DIDS在阻斷細(xì)胞容積減少中起重要作用，結(jié)合該實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)：缺血性腦損傷后，ClC-3氯通道表達(dá)增強(qiáng)，Cl-伴隨K+的流出的同時(shí)也攜帶了細(xì)胞內(nèi)水分大量外流，細(xì)胞容積減少進(jìn)而誘發(fā)神經(jīng)元的凋亡。ClC-3氯通道參與細(xì)胞凋亡的具體途徑有待進(jìn)一步研究。

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(2013-06-05收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

Effect of ClC-3 on hippocampal neuronal apoptosis of rats induced by SIN-1

JINXiaoxiao1),ZHANGShuling2),XULijuan3),FANHongling1),ZHONGZhichao1),LIXi1),CHANGQuanzhong1)

1)DepartmentofPhysiology，ZhuhaiCampusofZunyiMedicalCollege,Zhuhai519041 2)DepartmentofPediatrics,ZhuhaiCampusofZunyiMedicalCollege,Zhuhai519041 3)DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstHospitalofPutianCity，Putian351100

ClC-3 chloride channel;SIN-1;hippocampal neuron;cell apoptosis;DIDS

Aim: To explore the expression of ClC-3 in the hippocampal neuronal apoptosis of rats induced by SIN-1. Methods: The hippocampal neurons from SD rats cultured for 12 days were randomly allocated into control group,SIN-1 group and SIN-1+DIDS group. The neurons in control group were not treated;the neurons in SIN-1 group were treated with 0.5 mmol/L SIN-1 for 18 h,and the neurons in SIN-1+DIDS group were treated with 0.5 mmol/L SIN-1 and 0.1 mmol/L DIDS for 18 h.Immunofluorescent staining, Western blot and PCR method were used to detect the expression of ClC-3 chloride. Results: The expressions of ClC-3 and Caspase-3 were different among the 3 groups(protein:FCaspase-3=118.330,P<0.001;FClC-3=102.750,P<0.001;mRNA：FClC-3=32.955,P<0.001). The expression of ClC-3 was enhanced after the SIN-1 induce neuronal apoptosis. Chloride channel blocker DIDS could significantly weaken the expression of ClC-3 inducing by SIN-1.Conclusion: ClC-3 may participate in the hippocampal neuron apoptosis induced by SIN-1.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.006

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 81160157；貴州省優(yōu)秀科技人才省長(zhǎng)基金 201209

R332