孫高潔,王 姣,崔 巖,王守俊

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 450052

β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑對(duì)小鼠脂肪細(xì)胞中UCP1和磷酸化p38蛋白表達(dá)的影響

孫高潔,王 姣,崔 巖,王守俊#

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 450052

#通訊作者，男，1967年11月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向：2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制和防治，E-mail:wangshoujun02@126.com

β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑；脂肪細(xì)胞;解偶聯(lián)蛋白1;p38/MAPK通路；小鼠

目的：探討β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑CL-316243對(duì)脂肪細(xì)胞中解偶連蛋白1(UCP1)表達(dá)的影響。方法將3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)成為脂肪細(xì)胞，隨機(jī)分為4組，分別采用常規(guī)培養(yǎng)基(空白對(duì)照組)、10 μmol/L p38/MAPK抑制劑SB203580(SB203580組)、10-7mol/L β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑CL-316243聯(lián)合10 μmol/L SB203580(CL-316243+SB203580組)、10-7mol/L CL-316243(CL-316243組)處理。48 h后，RT-PCR法檢測(cè)4組細(xì)胞中UCP1 mRNA表達(dá)水平，Western blot法檢測(cè)空白對(duì)照組、CL-316243+SB203580組和CL-316243組細(xì)胞中p38蛋白磷酸化程度。結(jié)果CL-316243組、空白對(duì)照組、SB203580組和CL-316243+SB203580組細(xì)胞中UCP1 mRNA的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FCL-316243=204.043,FSB203580=151.736,F交互=143.308,P<0.001)，CL-316243組表達(dá)水平較其他3組明顯增高(P<0.05)。CL-316243組細(xì)胞中p38蛋白磷酸化程度較空白對(duì)照組和CL-316243+SB203580組升高(F=137.339,P<0.001)，后2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論CL-316243可能通過激活p38/MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)脂肪細(xì)胞中UCP1的表達(dá)。

隨著人們生活方式的改變和生活水平的提高，肥胖癥和2型糖尿病的發(fā)病率逐年升高。人體內(nèi)有兩種脂肪組織，即白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)和棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)，WAT與BAT在能量代謝中發(fā)揮著截然相反的作用,WAT主要通過甘油三酯貯存能量, 而BAT則消耗能量[1]，高水平的BAT有助于減輕體重和維持機(jī)體血糖穩(wěn)態(tài)[2-3]。因此促使WAT向BAT轉(zhuǎn)化可能是一個(gè)治療肥胖癥比較有效的方法。目前研究[4]發(fā)現(xiàn),β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑可刺激WAT的脂解，也可誘導(dǎo)WAT向BAT的轉(zhuǎn)化。解偶聯(lián)蛋白1(unconpling protein 1,UCP1)是一種在BAT中特異表達(dá)的線粒體內(nèi)膜蛋白質(zhì),是決定棕色脂肪組織功能的關(guān)鍵因素[5-6]，因此，它可成為一個(gè)衡量WAT向BAT轉(zhuǎn)化的特異性指標(biāo)。作者觀察了選擇性β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑CL-316243對(duì)小鼠脂肪細(xì)胞中UCP1和p38/MAPK信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響，探討β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑對(duì)WAT棕色化的影響及作用機(jī)制，為肥胖癥、糖尿病等相關(guān)代謝性疾病的診治提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來(lái)源和主要試劑小鼠前脂肪細(xì)胞株3T3-L1細(xì)胞購(gòu)自武漢博士德公司。地塞米松(dexamethasone，Dex)、胰島素、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(1-methyl-3-isobuthylxanthine，IBMX)和CL-316243均購(gòu)自Santa Cruz公司；Trizol試劑購(gòu)自TaKaRa公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR Master Mix購(gòu)自北京全式金公司;p38 MAPK抑制劑SB203580、p38抗體、磷酸化p38(p-p38)抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)成熟將3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至完全融合后換用含1 μmol/L Dex、0.5 μmol/L胰島素、0.5 mmol/L IBMX的DMEM高糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，3 d后換用含1 μmol/L Dex、0.5 μmol/L胰島素的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液1次，至第10天，約90%的細(xì)胞呈脂肪細(xì)胞表型，經(jīng)油紅O染色鑒定，證實(shí)為脂肪細(xì)胞。

1.3實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞分化成熟后，隨機(jī)分為4組，分別采用常規(guī)培養(yǎng)基(空白對(duì)照組)、10 μmol/L SB203580(SB203580組)、10-7mol/L CL-316243聯(lián)合10 μmol/L SB203580(CL-316243+SB203580組)、10-7mol/L CL-316243(CL-316243組)處理。

1.4細(xì)胞中UCP1mRNA的檢測(cè)細(xì)胞處理48 h后，采用RT-PCR法檢測(cè)UCP1 mRNA。根據(jù)GenBank中的UCP1(NM_009463.3)和內(nèi)參β-actin(NM_007393)基因序列設(shè)計(jì)引物， UCP1基因引物由寶生物公司合成，內(nèi)參β-actin引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。UCP1引物序列：上游5’-CACTCAGGATTGGCCTCTACGAC-3’，下游5’-GCTCTGGGCTTGCATTCTGAC-3’；β-actin引物序列：上游5’-GTCCCTCACCTCCCAAAA-3’，下游5’-GCT GCCTCAACACCTCAACCC-3’。用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，55.7 ℃(UCP1)或64.5 ℃(β-actin)退火30 s，72 ℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用UVP公司的VisionWorks LS軟件進(jìn)行分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的基因mRNA的表達(dá)水平。

1.5細(xì)胞中p-p38蛋白的檢測(cè)收集空白對(duì)照組、SB203580組和CL-316243+SB203580組處理48 h的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，采用Western blot檢測(cè)p38、p-p38蛋白。SDS-PAGE膠上每泳道上樣37.5 μg蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗均稀釋1 000倍，搖床4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5 min×3次，加HRP標(biāo)記的二抗(稀釋1 000倍)孵育1 h，洗滌3次后DAB顯色。用UVP公司的VisionWorks LS軟件進(jìn)行分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的表達(dá)水平。以p-p38/p38×100%表示p38磷酸化的程度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，4組間UCP1 mRNA表達(dá)水平的比較采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析,3組間p38磷酸化程度的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1油紅O染色鑒定結(jié)果見圖1。

圖1 貼壁后(A)及分化后(B，油紅O染色)細(xì)胞的形態(tài)觀察(×100)

2.2 4組脂肪細(xì)胞中UCP1mRNA表達(dá)水平的比較見圖2及表1。CL-316243組細(xì)胞中UCP1 mRNA的表達(dá)水平較空白對(duì)照組、SB203580組和CL-316243+SB203580組明顯升高(P<0.05)。

2.3空白對(duì)照組、CL-316243+SB203580組和CL-316243組脂肪細(xì)胞中p38磷酸化程度的比較見圖3和表2。CL-316243組細(xì)胞中p38磷酸化程度較空白對(duì)照組、CL-316243+SB203580組明顯升高；后2組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 4組脂肪細(xì)胞中UCP1 mRNA的表達(dá)

A:空白對(duì)照組；B：SB203580組；C:CL-316243+SB203580組；D:CL-316243組。

表1 4組細(xì)胞中UCP1 mRNA表達(dá)水平的比較(n=3)

FCL-316243=204.043,FSB203580=151.736,F交互=143.308,P<0.001。

圖3 3組細(xì)胞中p-p38蛋白的表達(dá)

A:空白對(duì)照組；C：CL-316243+SB203580組；D:CL-316243組。

表2 3組細(xì)胞中p38磷酸化程度的比較

F=137.339,P<0.001;*:與其他2組比較，P<0.05。

3 討論

β3 腎上腺素能受體主要調(diào)節(jié)機(jī)體的脂肪分解和產(chǎn)熱過程，它被激活后可上調(diào)UCP1的表達(dá),從而誘導(dǎo)WAT的棕色化[7]。已有文獻(xiàn)[8]指出，去甲腎上腺素刺激β3腎上腺素能受體后可激活cAMP-PKA通路，引起UCP1快速調(diào)節(jié)物(如FFA)的釋放，也可激活p38/MAPK通路，從而上調(diào)UCP1的表達(dá)。

該研究結(jié)果顯示，CL-316243組細(xì)胞中UCP1mRNA表達(dá)水平和p38磷酸化程度均較空白對(duì)照組明顯升高,說明CL-316243可促進(jìn)脂肪細(xì)胞中UCP1的表達(dá)和p38的磷酸化，激活p38/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路；SB203580組細(xì)胞UCP1 mRNA表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明p38抑制劑本身并不會(huì)影響脂肪細(xì)胞中UCP1的表達(dá)；CL-316243組細(xì)胞中UCP1 mRNA表達(dá)水平和p38磷酸化程度均高于CL-316243+SB203580組，說明p38抑制劑SB203580確實(shí)抑制了p38的磷酸化，而之前已驗(yàn)證p38抑制劑SB203580本身并不會(huì)影響UCP1的表達(dá)，所以p38/MAPK信號(hào)通路可能參與了CL-316243誘導(dǎo)UCP1表達(dá)的過程。

因此，可以看出，β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑在誘導(dǎo)WAT棕色化過程中發(fā)揮了一定的作用，這就為臨床上研究新型高效能的抗肥胖和糖尿病藥物提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(2013-11-07收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Effect of β3-adrenoceptor agonist on expression of UCP1 and phosphorylated p38 in mouse adipocytes

SUNGaojie，WANGJiao，CUIYan，WANGShoujun

DepartmentofEndocrinology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

β3-adrenoceptor agonist;adipocyte;uncoupling protein 1;p38/MAPK;mouse

Aim: To investigate the effect of β3-adrenoceptor agonist CL-316243 on expression of uncoupling protein 1(UCP1) in mouse adipocytes. Methods: 3T3-L1 preadipocytes were induced into adipocytes,then the adipocytes were divided into four groups:blank control group, p38/MAPK inhibitor SB203580 group,10-7mol/L CL-316243 combined with SB203580 group,10-7mol/L CL-316243 group.The adipocytes were treated with these regents for 48 h,then the expression level of UCP1 mRNA was evaluated by RT-PCR,and the phosphorylated p38(p-p38) was evaluated by Western blot. Results: The expression level of UCP1 mRNA in CL-316243 group was higher than those in the other 3 groups(FCL-316243=204.043,FSB203580=151.736,Finteraction=143.308,P<0.001).The p-p38 expression in CL-316243 group was higher than those in the blank control group and CL-316243 + SB203580 group(F=137.339,P<0.001)，but those in the other 2 groups had no statistical significance(P>0.05).Conclusion: β3-adrenoceptor agonist CL-316243 can promote the expression level of UCP1 in adipocytes through activating p38/MAPK signaling pathway.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.012

R589.2