黃尚 朱同玉 戎瑞明

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科，上海 200032)

1 引言

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)在器官移植免疫中起著重要的免疫抑制作用。Treg分為胸腺自然發(fā)育的自然調(diào)節(jié)T細(xì)胞(natural Treg,nTreg)和在外周免疫器官中經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞(induced Treg,iTreg)。這兩種Treg都可對(duì)免疫活動(dòng)起抑制作用，但二者作用不完全一致。nTreg主要負(fù)責(zé)內(nèi)源性抗原耐受[1-2]，而iTreg主要負(fù)責(zé)外源性抗原耐受[3-5]。因此，鑒別這兩種Treg以及誘導(dǎo)可致外源性抗原耐受的iTreg具有重要的臨床意義。

2 nTreg及iTreg的鑒別

2.1 nTreg和iTreg的功能區(qū)分 iTreg及其前體普通T細(xì)胞(conventional T cell,Tconv)的T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)庫(kù)主要負(fù)責(zé)識(shí)別外源性抗原[3,6-7]。在小鼠模型和人群中iTreg功能下降均可導(dǎo)致外源性抗原耐受下降和炎癥性腸炎的發(fā)生[4,8]。Xu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，輸注iTreg可降低氣道高反應(yīng)性，抑制嗜酸性粒細(xì)胞聚集，降低IgE水平，減輕哮喘模型的炎性反應(yīng)。腎移植患者的CD4+CD25+Foxp3+IFNγ+的iTreg與移植腎長(zhǎng)期存活率相關(guān)[9]。因此，iTreg在功能上傾向于抑制外源性抗原產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。

2.2 nTreg和iTreg的研究模型 目前尚無(wú)理想的用于鑒別nTreg和iTreg的分子標(biāo)志物。因此，對(duì)這兩個(gè)細(xì)胞亞群的功能研究一般應(yīng)用因抗原編碼基因缺陷而不能產(chǎn)生成熟T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的Rag-/-小鼠[10]，將特異的抗原基因轉(zhuǎn)入該種小鼠體內(nèi)以產(chǎn)生抗原特異性的單克隆iTreg或是將體外培養(yǎng)的nTreg或iTreg輸入體內(nèi)[1,11]；也可采用無(wú)法產(chǎn)生iTreg的CNS1-/-小鼠與野生型或經(jīng)其他處理小鼠對(duì)照，研究iTreg的功能[1,12]。

2.3 nTreg和iTreg的分子標(biāo)志物

2.3.1 Helios Helios是Ikaros轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員。Ikaros家族在淋巴細(xì)胞的生成、活化及穩(wěn)態(tài)維持中起重要作用[13]。Thornton等[14]曾發(fā)現(xiàn)，Helios是nTreg的特異性標(biāo)志物。然而，近年來(lái)，不支持該結(jié)論的證據(jù)也有很多，例如Verhagen等[15]研究中的Rag-/- Tg4轉(zhuǎn)基因小鼠無(wú)法產(chǎn)生nTreg，其Treg理論上應(yīng)該均為Helios-，但給予外源性抗原刺激后，該小鼠外周Helios+Treg占Treg總數(shù)的50％～60％；Gottschalk等[16]在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，iTreg可表達(dá)Helios；Zabransky等[17]亦發(fā)現(xiàn)，Helios是否表達(dá)與Treg是否來(lái)源于外周無(wú)關(guān)，而Treg的調(diào)節(jié)活性與Helios+Treg的絕對(duì)數(shù)量呈正比。由此可見，Helios可能是Treg行使功能的標(biāo)志物，而非nTreg的特有標(biāo)志物。目前對(duì)Helios的功能爭(zhēng)議很大，但得到公認(rèn)的是Helios+Treg在Treg群體中具有特殊的功能和地位，因此，對(duì)于Helios的具體作用還需要深入研究。

2.3.2 Neuropilin-1 Neuropilin-1(Nrp-1)表達(dá)于淋巴細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞表面，曾被作為區(qū)分Treg和Tconv的標(biāo)志物[18]。近年來(lái)，Weiss等[19]和Yadav等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，Nrp-1在nTreg中高表達(dá)，而iTreg低表達(dá)或不表達(dá)Nrp-1。Nrp-1作為分子標(biāo)志物的最大優(yōu)勢(shì)在于它表達(dá)于細(xì)胞表面，故便于Nrp-1+Treg的分離、純化。但是，Weiss等[19]在小鼠實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)和肺炎模型中均發(fā)現(xiàn)Nrp-1- iTreg可轉(zhuǎn)換為Nrp-1+iTreg的現(xiàn)象，因此，免疫微環(huán)境對(duì)Nrp-1的表達(dá)可能也有影響。

對(duì)于Helios作為nTreg的標(biāo)志物爭(zhēng)議很大，而Nrp-1在炎性反應(yīng)環(huán)境中又可在iTreg中表達(dá)，因此，這兩種分子的表達(dá)、功能和分布仍需深入研究，同時(shí)仍有待尋找新的nTreg或iTreg標(biāo)志物。

2.4 基因表達(dá) nTreg和Tconv表達(dá)的基因不盡相同，例如，Itgae、Nrp1等基因由nTreg所特有[21]?？诜庖咴纱碳conv表達(dá)Foxp3等Treg必須的基因，從而使Tconv轉(zhuǎn)化為iTreg并行使調(diào)節(jié)功能。iTreg中某些和調(diào)節(jié)功能無(wú)關(guān)的基因的表達(dá)程度更接近其前體Tconv而非nTreg，例如Igfbp4和Dapl1基因在nTreg及其前體細(xì)胞均低表達(dá)或不表達(dá)，而在Tconv及iTreg均高表達(dá)，甚至在Nrp-1+iTreg中Dapl1也高表達(dá)，說明其表達(dá)較穩(wěn)定[19]。因此，Tconv和iTreg均表達(dá)而nTreg不表達(dá)的基因及其產(chǎn)物有望成為區(qū)分iTreg和nTreg的較好的分子標(biāo)志物，有待深入研究。

3 iTreg生成的誘導(dǎo)

免疫復(fù)合物、共刺激信號(hào)、細(xì)胞因子等作用均與iTreg的增殖有關(guān)，傳染耐受(infectious tolerance)機(jī)制也可能與iTreg的誘導(dǎo)產(chǎn)生有關(guān)。

3.1 影響iTreg生成的因素

3.1.1 免疫復(fù)合物及共刺激因子 誘導(dǎo)iTreg生成的條件與nTreg有許多不同。弱抗原刺激產(chǎn)生的iTreg會(huì)被誘導(dǎo)凋亡，而低劑量強(qiáng)抗原刺激產(chǎn)生的iTreg可持續(xù)在外周行使功能，低TCR-pMHC免疫復(fù)合物刺激強(qiáng)度和一定的持續(xù)時(shí)間均是有利于iTreg在體內(nèi)生成的因素[22]。CD28是抗原信號(hào)傳遞的重要共刺激因子，體外和體內(nèi)研究[23]發(fā)現(xiàn)，CD28共刺激強(qiáng)度與iTreg生成負(fù)相關(guān)，強(qiáng)烈的CD28共刺激信號(hào)可抑制iTreg產(chǎn)生，且CD28共刺激強(qiáng)度是影響iTreg生成的一個(gè)獨(dú)立因素。細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4)是T細(xì)胞活化的重要負(fù)性共刺激因子。體外研究[24]發(fā)現(xiàn)，CTLA-4-/-小鼠的CD4+CD25- T細(xì)胞無(wú)法被誘導(dǎo)表達(dá)Foxp3而轉(zhuǎn)化為iTreg，在野生型CD4+CD25- T細(xì)胞中使用抗體阻斷CTLA-4也可抑制TGF-β對(duì)Foxp3+iTreg的誘導(dǎo)作用。

除了CD28和CTLA-4，程序性死亡受體配體-1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)等分子也可作為共刺激因子發(fā)揮作用。在體外，使用PD-L1包被磁珠可誘導(dǎo)iTreg的免疫調(diào)節(jié)功能，且PD-L1-/- APC無(wú)法使幼稚CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iTreg；在體內(nèi)，PD-L1-/-小鼠的iTreg生成明顯受到抑制[25]。補(bǔ)體片段C3a和C5a的受體C3aR和C5aR可提供效應(yīng)T細(xì)胞的共刺激信號(hào)，維持其生存和促進(jìn)活化。然而，在Treg細(xì)胞中，不管體外還是體內(nèi)，無(wú)論是在蛋白層面或基因?qū)用?，阻斷C3aR和C5aR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)都可抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)Foxp3的表達(dá)而促進(jìn)iTreg生成[26]。

3.1.2 細(xì)胞因子 IL-2是誘導(dǎo)iTreg生成的重要細(xì)胞因子。在體外和體內(nèi)，IL-2需要TGF-β共同作用才能使CD4+CD25- T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+T細(xì)胞而生成iTreg[27]。實(shí)驗(yàn)和數(shù)學(xué)建模分析顯示，iTreg只能利用周圍約10μm 范圍內(nèi)的IL-2，而iTreg本身并不分泌IL-2，這可能是限制iTreg在體內(nèi)產(chǎn)生的因素之一[28-29]。除了IL-2，TGF-β也是誘導(dǎo)iTreg必不可少的細(xì)胞因子。TGF-β可增強(qiáng)活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)和Smad3與保守非編碼序列-1(conserved non-coding sequence-1,CNS-1)增強(qiáng)子的結(jié)合，增強(qiáng)CNS-1 DNA組氨酸的乙?；?，經(jīng)過一系列步驟誘導(dǎo)Foxp3的表達(dá)[30]。體外誘導(dǎo)的iTreg并不穩(wěn)定，Selvaraj等[31]對(duì)TGF-β和iTreg的作用進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然TGF-β可將約90％的幼稚T細(xì)胞誘導(dǎo)為iTreg，但培養(yǎng)體系中去除TGF-β后4 d即可觀察到Foxp3表達(dá)下降。

3.2 iTreg與傳染耐受 傳染耐受是指，在抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)的輔助下，已有的Treg可將幼稚T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成iTreg。此過程綜合了有利于iTreg生成的各項(xiàng)因素，指明iTreg的來(lái)源即幼稚T細(xì)胞，提供了在體內(nèi)不斷生成iTreg的可能性。

Cobbold等[32]提出了傳染耐受機(jī)制的模型(圖1)。在這個(gè)模型中，APC和Treg將幼稚T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iTreg的過程發(fā)生在微觀的免疫微環(huán)境中，Treg表面的IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子和CTLA-4等抑制性共刺激信號(hào)由Treg提供，上調(diào)APC的必需氨基酸(essential amino acid,EAA)代謝酶，使微環(huán)境中的色氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、組氨酸等EAA減少，從而通過mTOR信號(hào)通路抑制幼稚T細(xì)胞向效應(yīng)性T細(xì)胞分化。與此同時(shí)，Treg和APC在TGF-β的作用下分別表達(dá)CD39和CD73，將ATP降解為腺苷。在TGF-β、腺苷、ATRA和mTOR信號(hào)通路的共同作用下，幼稚T細(xì)胞即可轉(zhuǎn)化為iTreg。

圖1 傳染耐受的發(fā)生過程，引自文獻(xiàn)[32]

EAA對(duì)幼稚T細(xì)胞分化方向的影響已成為免疫代謝研究?jī)?nèi)容的一部分。當(dāng)免疫微環(huán)境中有足夠氨基酸、糖、脂質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，幼稚T細(xì)胞傾向于啟動(dòng)PI3K/AKT/mTOR通路，以有氧糖酵解供能分化為效應(yīng)性T細(xì)胞[33]；而當(dāng)這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足時(shí)，幼稚T細(xì)胞則傾向于啟動(dòng)LKB1/AMPK通路，以氧化磷酸化供能分化為Treg[34]。傳染耐受模型將各種細(xì)胞因子、共刺激因子、APC、腺苷、ATRA等一系列已被證明可調(diào)節(jié)iTreg生成的因素綜合起來(lái)，與最近流行的免疫代謝學(xué)說也有很大的交集。研究傳染耐受的調(diào)控可能對(duì)免疫調(diào)節(jié)的臨床應(yīng)用開拓新的思路，值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

盡管iTreg的研究取得了很多進(jìn)展，但仍有很多關(guān)鍵問題尚待解決，包括尋找iTreg特異的表面標(biāo)志物或表面標(biāo)志物集合、iTreg在免疫穩(wěn)態(tài)和免疫耐受中的作用范圍、利用傳染耐受有效地在體內(nèi)誘導(dǎo)大量特異性或非特異性iTreg生成、增強(qiáng)iTreg在體內(nèi)的穩(wěn)定性以及iTreg的臨床應(yīng)用等。

iTreg細(xì)胞的最終應(yīng)用目的是維持正常人的免疫穩(wěn)態(tài)或者誘導(dǎo)移植患者的免疫耐受。過多CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞可破壞免疫穩(wěn)態(tài)，誘發(fā)自身免疫性疾病，在移植患者中產(chǎn)生移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)或排斥移植器官；而過多CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞會(huì)限制免疫系統(tǒng)對(duì)外來(lái)病原體的正常防御作用和對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視作用[35]。因此，只有對(duì)iTreg進(jìn)行深入研究，才可能使其安全有效地早日應(yīng)用于臨床。

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