武書哲 ，張 娜 ，田淑芬

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究中心，天津 300387；3.天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點實驗室，天津 300192）

無核葡萄以其食用方便、品質(zhì)優(yōu)良在市場上越來越受歡迎，因此選育優(yōu)質(zhì)、大粒、無核葡萄品種已成為葡萄育種的重要內(nèi)容之一。我國的無核葡萄育種多采用傳統(tǒng)的雜交方式，即利用有核品種作母本，無核品種作父本，但是其獲得無核后代的幾率較低，而且育種周期長；三倍體雜交育種雖可以獲得無核葡萄，但是二倍體與四倍體的親和力差，獲得雜交后代難度同樣很大。1982年，美國葡萄育種學(xué)家Ramming等[1]首次報道了利用改良的White培養(yǎng)基進行無核葡萄胚的胚珠內(nèi)培養(yǎng)，并獲得了兩株實生苗。自此以后，利用胚挽救技術(shù)，將無核葡萄品種做母本，在合子胚敗育之前將其取出并在適宜的條件下離體培養(yǎng)，使其繼續(xù)發(fā)育成苗，最終形成完整植株，不僅極大地提高后代的無核率，也加快了無核葡萄的育種速度。

本試驗以希姆勞特（歐美雜交種，從日本引入，美國育種，該品種豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗性強、適應(yīng)性廣，在無核葡萄中，屬大粒大穗型品種）為母本，與玫瑰香優(yōu)系（天津市農(nóng)科院葡萄研究中心從表面上玫瑰香葡萄篩選，較普通玫瑰香品種香氣濃郁，果穗松緊度適中，果粒均勻），雜交進行玫瑰香型無核大粒的新品種繁育，研究胚挽救過程中培養(yǎng)基及添加物不同濃度對胚發(fā)育的影響，旨在確定適宜無核葡萄希姆勞特的胚挽救幼胚離體培養(yǎng)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及胚挽救的基本方法

本試驗于2013～2014年在天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究中心和天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點實驗室進行。雜交材料為希姆勞特×玫瑰香。

在初花期采集父本的花粉，花前3～4d母本去雄，柱頭上開始分泌粘液時授粉，以24h為間隔連續(xù)授粉3次。

在葡萄開花授粉后25d起每隔7d對希姆勞特×玫瑰香胚珠的發(fā)育及敗育勢態(tài)進行了定期觀察。隨機取20粒果實，稱其漿果單粒重，然后剝開果實，取出胚珠，稱取胚珠的平均重量，統(tǒng)計其胚珠平均發(fā)育程度及不同時期漿果內(nèi)的胚珠數(shù)。

胚挽救的程序參照王愛玲[2]的方法進行，從剖開的胚珠中選取長度大于2mm的胚珠接種在發(fā)育培養(yǎng)基上進行胚珠內(nèi)胚培養(yǎng)。每個三角瓶（150mL）內(nèi)接種15個胚珠，培養(yǎng)60d后無菌條件下剖開胚珠，在胚珠喙端發(fā)現(xiàn)的白色胚即為發(fā)育胚。統(tǒng)計接種胚珠數(shù)、胚發(fā)育數(shù)、胚發(fā)育率。胚發(fā)育率=胚發(fā)育數(shù)/接種胚珠數(shù)×100%。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同基本培養(yǎng)基試驗

取希姆勞特×玫瑰香授粉后32d的雜交胚珠接種在ER/Nitsch+GA30.5mg/L+IAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖60g/L+活性炭1g/L+瓊脂5g/L這兩種培養(yǎng)基中，篩選適宜的基本培養(yǎng)基。

1.2.2 培養(yǎng)基中添加不同濃度6-BA的離體培養(yǎng)試驗

取希姆勞特×玫瑰香授粉后32d的雜交胚珠接種在 Nitsch+GA30.5mg/L+IAA1.5mg/L+蔗糖60g/L+活性炭1g/L+瓊脂5g/L培養(yǎng)基中，其中分別添加不同濃度（0.2、0.5、0.8mg/L）的 6-BA，研究不同濃度的6-BA對胚發(fā)育的影響。

1.2.3 培養(yǎng)基中添加不同濃度活性炭的離體培養(yǎng)試驗

取希姆勞特×玫瑰香授粉后32d的雜交胚珠接種在 Nitsch+GA30.5mg/L+IAA1.5mg/L+蔗糖60g/L+6-BA0.5mg/L+瓊脂5g/L培養(yǎng)基中，其中分別添加不同濃度（1、1.5、3g/L）的活性炭，研究不同濃度的活性炭對胚發(fā)育的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 希姆勞特果實、胚珠重及胚珠數(shù)的變化

通過定期觀察胚珠的發(fā)育動態(tài)，可以看出母本果實重量一直呈增加趨勢，胚珠重呈先增加后下降趨勢，在授粉后32d胚珠重達到最大。由此可知，希姆勞特胚敗育時期在授粉后32d。單粒漿果內(nèi)發(fā)育胚珠的平均數(shù)隨漿果的逐漸增大而減少，也說明了胚珠的敗育逐漸增強（表1）。

表1 不同時期希姆勞特果實、胚珠重及胚珠數(shù)

2.2 不同基本培養(yǎng)基對葡萄離體幼胚發(fā)育的影響

通過不同基本培養(yǎng)基離體培養(yǎng)胚珠試驗，可以看出希姆勞特×玫瑰香的雜交胚珠在Nitsch培養(yǎng)基中胚發(fā)育率明顯高于ER，所以希姆勞特幼胚較適宜在Nitsch培養(yǎng)基中培養(yǎng)（表2）。

表2 不同基本培養(yǎng)基對胚發(fā)育的影響重及胚珠數(shù)

2.3 不同濃度6-BA對葡萄離體幼胚發(fā)育的影響

通過培養(yǎng)基中添加不同濃度6-BA的離體培養(yǎng)試驗，可以看出0.5mg/L 6-BA的胚發(fā)育率最高，為13.33%，其次是0.8mg/L 6-BA，胚發(fā)育率為10.67%，而0.2mg/L 6-BA的胚發(fā)育率最低，為9.33%（表3）。

表3 不同濃度6-BA對胚發(fā)育的影響

2.4 不同濃度活性炭對葡萄離體幼胚發(fā)育的影響

通過培養(yǎng)基中添加不同濃度活性炭的離體培養(yǎng)試驗，可以看出1g/L活性炭的胚發(fā)育率最高，為13.33%，其次是1.5g/L活性炭的胚發(fā)育率為5.33%，而3g/L活性炭的胚發(fā)育率最低，為5.17%（表4）。

表4 不同濃度活性炭對胚發(fā)育的影響

3 討論

胚挽救技術(shù)雖然使無核葡萄生物育種成為可能，但是它目前仍然存在很多問題，成苗率低，技術(shù)要求高，胚挽救苗較弱等，如何提高胚挽救過程中胚發(fā)育率，是提高無核育種技術(shù)效率的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。

培養(yǎng)基在胚珠離體培養(yǎng)條件下可以提供幼胚繼續(xù)發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)和激素，是影響胚挽救是否成功的重要因素之一[1]。郝燕、田莉莉[3-4]經(jīng)過試驗研究認為，在胚珠培養(yǎng)階段使用ER固-液雙相培養(yǎng)基胚發(fā)育較好。而唐冬梅[5]則認為，MM3作為胚發(fā)育培養(yǎng)基效果最好。蔣愛麗等則育成了胚培的新品種[6]。

未成熟葡萄幼果中含有較多的酚類物質(zhì)，使得在胚挽救中發(fā)生嚴重褐變，從而降低胚挽救成苗率?；钚蕴坑兄诮档团咧楹只膸茁蔥7-8]。雖然活性炭有吸附作用，可以吸收有害物質(zhì)，但也可能吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，因此要適量添加，一般為0.1%～0.3%。Nookaraju[9]發(fā)現(xiàn)在圓錐花序上噴涂吡效?。–PPU）并且在胚珠培養(yǎng)基中添加丙烯酸丙酯（BA）可以提高胚珠敗育型葡萄的胚挽救效率。

本研究確定了適宜無核葡萄希姆勞特的胚挽救幼胚離體培養(yǎng)體系：無核葡萄希姆勞特品種適宜用含 GA30.5mg/L、蔗糖 60g/L、瓊脂 5g/L、pH值5.8的Nitsch培養(yǎng)基作胚珠發(fā)育培養(yǎng)基，添加0.5mg/L 6-BA、1.0mg/L活性炭，胚發(fā)育率最高，達到13.33%。此結(jié)果為進一步研究利用無核葡萄希姆勞特胚挽救選育玫瑰香型大粒無核葡萄技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

［1］Ramming D-W，Emershad R L.In-ovule embryo culture of seeded and seedlessVitis vinifera（Abst）［J］.Hortseience，1982，17（3）：487.

［2］王愛玲，王躍進，唐冬梅，等.提高無核葡萄胚挽救中幼胚成苗率的研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（20）：4238-4245.

［3］郝燕，楊瑞，王鴻，等.無核葡萄剝胚胚挽救技術(shù)關(guān)鍵影響因子［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，（9）.

［4］田莉莉.抗病無核葡萄胚挽救育種及種質(zhì)創(chuàng)新［D］.陜西安：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2007.

［5］唐冬梅，王躍進，趙榮華，等.我國研究出無核葡萄育種新技術(shù)［J］.吉林農(nóng)業(yè)農(nóng)村經(jīng)濟信息，2005，（8）：47.

［6］蔣愛麗，李世誠，金佩芳，等.胚培無核葡萄新品種—滬培 1號［J］.果樹學(xué)報，2007，24（3）：402-403.

［7］郭印山.葡萄胚敗育機理與胚挽救技術(shù)研究［D］.沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［8］田莉莉.抗病無核葡萄胚挽救育種及種質(zhì)創(chuàng)新［D］.西安：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2007.

［9］ANookaraju，M S Barreto，G S Karibasappa，et al.Synergistic effect of CPPU and benzyladenine on embryo rescue in six stenospermocarpic cultivars of grapevine［J］.Vitis，2007，46（4）：188-191.