福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院藥學(xué)部，福建 漳州 363000

RP-HPLC法測(cè)定人血清中萬(wàn)古霉素的濃度

陳宜鋒李碧峰*黃小紅馮惠平

福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院藥學(xué)部，福建 漳州 363000

目的建立血清中萬(wàn)古霉素濃度的反相高效液相色譜法的測(cè)定方法。方法以去甲萬(wàn)古霉素為內(nèi)標(biāo)，血清樣品經(jīng)10%高氯酸溶液沉淀，采用TC-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀(18∶82)為流動(dòng)相，流速為1.0 ml·min-1，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。結(jié)果在1.0～100.0 mg·L-1濃度范圍內(nèi)線性良好(r=0.999 89，n=7)，回收率高，日內(nèi)、日間RSD均小于3%，理論塔板數(shù)大于6 000，最低檢測(cè)限為0.12 mg·L-1。結(jié)論本法樣品取樣量少，處理方法簡(jiǎn)便，靈敏度高，方法準(zhǔn)確穩(wěn)定，回收率高，適用于臨床常規(guī)血藥濃度監(jiān)測(cè)及相關(guān)科研的應(yīng)用。

萬(wàn)古霉素；去甲萬(wàn)古霉素；血藥濃度；高效液相色譜法

萬(wàn)古霉素(vancomycin，VAN)臨床主要用于治療革蘭陽(yáng)性菌嚴(yán)重感染，也用于血液透析患者發(fā)生葡萄球菌屬所致的動(dòng)靜脈分流感染，口服適用于甲硝唑無(wú)效的假膜性結(jié)腸炎或多重耐藥葡萄球菌小腸結(jié)腸炎[1]。但高濃度的萬(wàn)古霉素可導(dǎo)致可逆性耳聾、耳鳴、聽(tīng)力損害及腎損害等不良反應(yīng)，毒性較大，且萬(wàn)古霉素的耐藥菌感染成為臨床上非常棘手的問(wèn)題，因此在臨床應(yīng)用過(guò)程中特別是存在腎功能損害或合并使用有腎功能損害的藥物時(shí)，需要監(jiān)測(cè)人體內(nèi)的血藥濃度。本實(shí)驗(yàn)摸索了高效液相色譜法測(cè)定人血清中萬(wàn)古霉素的濃度，可供臨床日常監(jiān)測(cè)使用。

1 儀器與試劑

Aglient HPLC 1100型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；ChemStation A.10.OX化學(xué)工作站；WH-861旋渦混合器(太倉(cāng)市科教器材廠)；TP-300型超聲波清洗機(jī)(北京天鵬電子新技術(shù)有限公司)；SIGMA-3K15離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；AE-240型電子分析天平(梅特勒托利多有限公司)；185個(gè)人型超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)；AE-320型pH計(jì)(梅特勒托利多有限公司)。

萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇(色譜純，美國(guó)Tedia公司)；超純水(本實(shí)驗(yàn)室制備，即蒸餾水經(jīng)Millipore純水機(jī)去離子水)；血清(門(mén)診健康體檢者，由我院檢驗(yàn)科提供)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為磷酸二氫鉀緩沖液(0.05 mol·ml-1，pH=3.2)-甲醇(82∶18)(V/V)；流速為1.0 ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；柱溫為33℃；進(jìn)樣量為20 μl。

2.2 溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)品的配制：精確稱取萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品50 mg于50 ml量瓶中，加水溶解至刻度，配成濃度為1 g/L的儲(chǔ)備液；臨用時(shí)精密量取萬(wàn)古霉素儲(chǔ)備液1 g/L適量分別稀釋成10.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、100 0.0 mg/L的溶液，置冰箱待用。

內(nèi)標(biāo)液的配制：精密稱取去甲萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品15 mg于25 ml量瓶中，加水溶解至刻度，配成濃度為0.6 g/L的溶液置冰箱待用。

2.3 血清樣品的處理 往空白血清中加入內(nèi)標(biāo)液20 μl，再加入10%高氯酸溶液40 μl，漩渦充分混勻3 min，10 000 rpm，4℃離心10 min，取上清液130 μl，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液10 μl，漩渦充分混勻30 s后，取上清液20 μl進(jìn)樣。

2.4 色譜分離情況 空白血清、血清中加標(biāo)準(zhǔn)品、血清中加內(nèi)標(biāo)物、血清中加標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物，分別按上述樣品處理方法進(jìn)行處理，結(jié)果見(jiàn)下圖1。由圖可見(jiàn)，在上述實(shí)驗(yàn)條件下，血清內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素均無(wú)干擾，且萬(wàn)古霉素與內(nèi)標(biāo)去甲萬(wàn)古霉素能有效分離。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取7根具塞試管中分別加入160 μl空白血清，每根試管中加入20 μl內(nèi)標(biāo)液，然后精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μl，依照順序加入試管中，按上述色譜條件處理樣品。以萬(wàn)古霉素的濃度X(C，mg·L-1)為橫坐標(biāo)，測(cè)得的萬(wàn)古霉素峰面積AV與內(nèi)標(biāo)液峰面積AN之比Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.016 014 22X-0.005 080 7(r=0.999 89，n=7)。表明萬(wàn)古霉素的血藥濃度在1.0～100.0 mg·L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，理論塔板數(shù)大于6 000。以大于基線3倍信噪比(S/N)為最低檢測(cè)限，得出萬(wàn)古霉素濃度最低檢測(cè)限為0.12 mg·L-1。

2.6 回收率試驗(yàn) 分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液適量，加入160μl空白血清中，配成濃度分別為10.0、40.0、80.0 mg·L-1的溶液各5份，按上述色譜條件處理，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出萬(wàn)古霉素的血藥濃度，以測(cè)得值與加入值之比計(jì)算回收率。結(jié)果低、中、高濃度的方法回收率分別為100.3%、99.8%、100.2%，平均回收率為100.1%。

表1 日內(nèi)精密度和日間精密度

2.7 精密度的測(cè)定 取低、中、高三種濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，分別配成濃度為10.0、40.0、80.0 mg·L-1的溶液各5份，按上述色譜條件處理，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出萬(wàn)古霉素的血藥濃度，每種濃度1天內(nèi)測(cè)定5次，測(cè)得的萬(wàn)古霉素濃度計(jì)算日內(nèi)精密度；同法操作以1周內(nèi)3個(gè)樣品每種濃度連續(xù)5天測(cè)得的萬(wàn)古霉素濃度計(jì)算日間精密度。結(jié)果低、中、高3種濃度的日內(nèi)RSD分別為1.60%、0.71%和0.65%，日間RSD分別為2.92%、1.19%和0.62%，均小于3%。記錄如表1。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液(40mg·L-1)20 μl按“2.6”項(xiàng)下操作，分別在0、6、12、24、48、72 h(除0 h外均行冷凍后再融處理)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，峰面積的RSD=1.46%，表明對(duì)照品溶液在72 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 樣品測(cè)定 取臨床血清樣品5份，按“2.3”項(xiàng)下操作，測(cè)定萬(wàn)古霉素血藥濃度分別為8.12、12.23、18.44、24.71、16.80 mg·L-1。萬(wàn)古霉素及內(nèi)標(biāo)物出峰時(shí)間快、患者血清內(nèi)源性雜質(zhì)影響較小，為臨床及時(shí)提供了調(diào)整給藥方案的依據(jù)。

3 討論

3.1 血清濃度與血漿濃度 有報(bào)道[2-4]考慮到只有游離型藥物才能運(yùn)到作用部位產(chǎn)生藥理效應(yīng)，通常也僅是其與藥理作用強(qiáng)度密切相關(guān)，大部分存在于血清中；結(jié)合型藥物相對(duì)分子質(zhì)量增大，不能跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝或排泄，暫時(shí)失去藥理作用而儲(chǔ)存在血液中。因此，筆者采用了測(cè)定藥物的血清濃度。

3.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇 關(guān)于內(nèi)標(biāo)物的選擇，一般選擇結(jié)構(gòu)相近的物質(zhì)。有報(bào)道[5]采用維生素B12作為內(nèi)標(biāo)，梯度洗脫后使維生素B12出峰提前，但其程序復(fù)雜，因此未用維生素B12作為內(nèi)標(biāo)液；還有文獻(xiàn)[4]指出用替硝唑作為內(nèi)標(biāo)，但是不能排除臨床應(yīng)用過(guò)程中由于患者同時(shí)感染厭氧菌而合并使用替硝唑而影響內(nèi)標(biāo)物定量的情況。而去甲萬(wàn)古霉素不僅結(jié)構(gòu)與萬(wàn)古霉素相近，其作用機(jī)制、抗菌譜、排泄途徑及適應(yīng)癥也均與萬(wàn)古霉素相似，且兩者不會(huì)同時(shí)使用，因此采用去甲萬(wàn)古霉素作為內(nèi)標(biāo)物。

3.3 蛋白沉淀劑的選擇 目前報(bào)道使用的蛋白沉淀劑有甲醇[4]、乙腈-異丙醇[3]、乙腈-二氯甲烷[6]、固相萃取[7]、三氯醋酸[8]或硫酸鋅[2]等。由于萬(wàn)古霉素不溶于甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑，固相萃取成本太高，三氯醋酸不穩(wěn)定需現(xiàn)用現(xiàn)配等原因，筆者初篩選出硫酸鋅和高氯酸作為蛋白沉淀劑來(lái)對(duì)比試驗(yàn)研究。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用20%硫酸鋅沉淀血清高速離心(10 000 rpm)后取出上清液不久，又再次出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，增加離心轉(zhuǎn)速(14 000 rpm)及延長(zhǎng)離心時(shí)間(20 min)后發(fā)現(xiàn)上述現(xiàn)象仍然如此。經(jīng)過(guò)反復(fù)驗(yàn)證，使用硫酸鋅沉淀都不能獲得滿意效果。筆者認(rèn)為可能由于硫酸鋅沉淀蛋白是可逆性的，取出上清液時(shí)硫酸鋅的濃度發(fā)生了變化，離心后放置一段時(shí)間，硫酸鋅復(fù)溶導(dǎo)致溶液渾濁影響進(jìn)樣。而高氯酸沉淀蛋白的過(guò)程是不可逆過(guò)程，可以使血清蛋白沉淀完全。但考慮到高氯酸是強(qiáng)酸，對(duì)色譜柱壽命有影響，所以最后加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液10 μl中和酸性以保護(hù)色譜柱。

此外，pH值對(duì)研究影響較大，過(guò)酸保留時(shí)間延長(zhǎng)，過(guò)堿保留時(shí)間縮短，且均會(huì)使峰面積降低，因此正確調(diào)節(jié)pH值至關(guān)重要。通過(guò)試驗(yàn)摸索最終確定33℃甲醇:磷酸二氫鉀(18:82，pH=3.2)時(shí)萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素的保留時(shí)間較合適且血清等內(nèi)源性雜質(zhì)無(wú)干擾，峰形較好，基線穩(wěn)定，準(zhǔn)確度及靈敏度高，重現(xiàn)性好。該方法樣品取樣量少，處理方法簡(jiǎn)便，適用于臨床常規(guī)血藥濃度監(jiān)測(cè)及相關(guān)科研的應(yīng)用。

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DeterminationofVancomycininHumanSerumbyRP-HPLC

CHEN Yi-feng,LI Bi-feng,HUANG Xiao-hong,FENG Hui-ping

Department of Pharmacy,，Zhangzhou Municipal Hospital Affiliated to Fujian Medical University，Zhangzhou 363000，China

ObjectiveTo develop a method for the determination of vancomycin concentration in human serum by high-performance liquid chromatography(HPLC).MethodNorvancomycin was used as internal standard and the sample deposited by 10% perchloric acid was separated on TC-C18 analysis column(250 mm×4.6 mm, 5 μm) with a mobile phase of mixture of methanol:0.05mol·L-1potassium dihydrogen phosphate(18∶82). The flow rate was 1ml/min, the UV detector wavelength was set up 230 nm.ResultThe calibrated linear plot of vancomycin was within 1.0～100.0 mg/L(r=0.999 89,n=7), the average recoveries in serum were high, intra-day RSD and inter-day RSD were both less than 3%, the theoretical plate number were more than 6 000,the limit of test was 0.12 mg·L-1.ConclusionThe method is accurate, simple, sensitive and suitable for the study of therapeutic drug monitoring for vancomycin in human serum in clinic and other fields.

vancomycin;norvancomycin; serum drug concentration;HPLC

陳宜鋒,主管藥師，主要從事臨床藥學(xué)研究。E-mail： brantchan@hotmail.com

李碧峰,副主任藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)研究。E-mail：lbf.307@163.com

R284.1

A

1007-8517(2014)11-0011-03

2014.04.07)