徐曉玲 曹 麗 沈 琴 戴躍青 王 璐 高蘇俊 王慶娜 田秀春 朱海杭

江蘇省蘇北人民醫(yī)院消化科 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院(225001)

膽汁反流性胃炎是慢性胃炎中的一種較常見類型，是由十二指腸胃反流引起的胃黏膜化學(xué)性炎癥，與萎縮、腸化生等胃黏膜癌前病變有關(guān)[1-2]。細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，屬于原癌基因中的一種，其過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖。既往研究[3]指出，cyclin D1與胃癌的關(guān)系密切。本研究通過探討cyclin D1在膽汁反流性胃炎和胃癌組織中的表達(dá)及其意義，旨在為胃癌的臨床防治提供理論依據(jù)。

對象與方法

一、研究對象

收集2012年6～12月江蘇省蘇北人民醫(yī)院行胃癌根治術(shù)的胃癌組織標(biāo)本50例、癌旁非癌組織(距癌組織邊緣3～5 cm)標(biāo)本50例、胃鏡下取得的膽汁反流性胃炎組織標(biāo)本50例。選取同期健康體檢者胃黏膜組織標(biāo)本50例作為正常對照。胃癌組織和癌旁非癌組織標(biāo)本經(jīng)HE染色后由組織病理學(xué)檢查確診。胃鏡檢查發(fā)現(xiàn)胃內(nèi)有綠色或黃色膽汁伴胃黏膜糜爛或充血者診斷為膽汁反流性胃炎[4-5]。入選患者年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、研究方法

1. 觀察膽汁反流性胃炎胃黏膜病變情況：取膽汁反流性胃炎和正常對照組標(biāo)本，采用新悉尼系統(tǒng)[6]評價(jià)胃黏膜組織腸上皮化生和異型增生的情況。

2. 免疫組化染色：取胃癌組、癌旁非癌組、膽汁反流性胃炎組以及正常對照組標(biāo)本，蠟塊切片，68 ℃烤片20 min，常規(guī)脫蠟，梯度酒精脫水，加熱檸檬酸緩沖液1～2 min至96 ℃，切片置于緩沖液中，微波爐加熱20 min，取出切片自然冷卻至室溫，滴加3% H2O2，37 ℃孵育10 min， PBS沖洗2 min×3次，滴加兔抗人cyclin D1單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)(1∶50)，4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗2 min×3次，滴加聚合物輔助劑，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗2 min×3次，滴加通用型二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)(1∶50)，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗2 min×3次，DAB溶液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、干燥、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知陽性切片作為陽性對照。

結(jié)果判斷：每例切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野進(jìn)行觀察。Cyclin D1染色陽性為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，且著色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者。參考孫桂彬等[7]的研究，根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例綜合判斷染色結(jié)果。染色強(qiáng)度：0分，無色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。陽性細(xì)胞比例：0分，≤5%；1分，5%～25%；2分，25%～50%；3分，≥50%。陽性標(biāo)記分?jǐn)?shù)=陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)×陽性細(xì)胞比例分?jǐn)?shù)： 0分，(-)；1～3分，(+)；4～5分，(++)；≥6分，(+++)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般情況

胃癌組中男27例，女23例，年齡43～71歲，平均(58.7±7.8)歲；癌旁非癌組中男18例，女32例，年齡33～73歲，平均(56.4±8.7)歲；膽汁反流性胃炎組中男19例，女31例，年齡21～75歲，平均(51.0±16.1)歲；正常對照組中男21例，女29例，年齡19～74歲，平均(50.0±13.1)歲。四組患者性別構(gòu)成、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、膽汁反流性胃炎胃黏膜病變情況

χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，膽汁反流性胃炎組發(fā)生腸上皮化生和異型增生的比例顯著高于正常對照組(P<0.05)(見表1)。

三、Cyclin D1表達(dá)情況

免疫組化染色結(jié)果顯示，cyclin D1陽性率在正常對照組、膽汁反流性胃炎組、癌旁非癌組以及胃癌組中逐漸升高。胃癌組cyclin D1陽性率顯著高于其余三組(P<0.05)，膽汁反流性胃炎組cyclin D1陽性率顯著高于正常對照組(P<0.05)，癌旁非癌組與膽汁反流性胃炎組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表1 膽汁反流性胃炎胃黏膜病變情況 n(%)

表2 四組間cyclin D1表達(dá)陽性率比較n(%)

討 論

膽汁反流性胃炎是由于幽門功能不全、胃竇十二指腸協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)障礙、胃排空延遲或膽囊功能障礙等因素導(dǎo)致過量含膽汁的十二指腸液返流入胃，破壞胃黏膜表面黏液屏障，損傷黏膜上皮，引起充血、水腫等炎性改變，其臨床表現(xiàn)缺乏特異性，主要依靠胃鏡診斷。研究[8-11]顯示，長期膽汁反流可導(dǎo)致胃小凹上皮和食管鱗狀上皮增生，并可能與腸化生甚至癌變有關(guān)。膽汁反流亦是導(dǎo)致Barrett食管及其惡性進(jìn)展的重要因素。本研究中，膽汁反流性胃炎組發(fā)生腸上皮化生和異型增生的比例分別為36.0%和44.0%，顯著高于正常胃黏膜組(分別為6%、10%)，提示膽汁反流性胃炎可能與胃癌的發(fā)生有一定關(guān)系。

Cyclin D是一組調(diào)控真核細(xì)胞周期進(jìn)展的重要蛋白分子，cyclin D1屬于其中一個(gè)重要亞型，是癌基因中的一種。Cyclin D1可結(jié)合細(xì)胞周期蛋白依賴激酶4(CDK4)形成復(fù)合物cyclin D1-CDK4，使Rb蛋白磷酸化，解除Rb基因抑制G期的作用。生理狀態(tài)下，細(xì)胞進(jìn)入S期后cyclin D1迅速分解。cyclin D1過表達(dá)可縮短G1期，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期[12]。對胃癌和癌前病變組織的研究[7,13]顯示，胃黏膜上皮癌變早期階段可見cyclin D1過表達(dá)，提示cyclin D1是重要的胃癌促發(fā)因素，可作為潛在的胃癌早期診斷的分子標(biāo)志。

本研究顯示，cyclin D1在正常胃黏膜組織、膽汁反流性胃炎組織、癌旁非癌組織以及胃癌組織中的陽性表達(dá)率逐漸升高，且在胃癌組織中顯著高于其余三組，提示cyclin D1在胃癌惡性演變過程中發(fā)揮重要作用。此外，cyclin D1在膽汁反流性胃炎組織中的表達(dá)顯著高于正常胃黏膜組織，但在癌旁非癌組織和膽汁反流性胃炎組織中無顯著差異，提示cyclin D1可能參與了膽汁反流性胃炎發(fā)展為胃癌的過程。

綜上所述，膽汁反流性胃炎作為臨床上較常見的一種慢性胃炎，與腸上皮化生和異型增生等胃黏膜癌前病變密切相關(guān)。癌基因cyclin D1在胃癌和膽汁反流性胃炎組織中高表達(dá)，提示其可能參與了膽汁反流性胃炎發(fā)展為胃癌的過程，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展存在一定關(guān)系，是重要的胃癌促發(fā)因素，可作為潛在的胃癌早期診斷的分子標(biāo)志。

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