朱 礫 楊 洋 劉東雷 郭海周 趙 松

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌發(fā)病率占肺癌總發(fā)病率的80%。肺癌起病隱襲、早期診斷率低，大多數(shù)患者在確診時(shí)已達(dá)中晚期，失去了外科治療的最佳時(shí)機(jī)。貝伐單抗是重組人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)單克隆抗體，相關(guān)試驗(yàn)已證明貝伐單抗對(duì)于肝細(xì)胞移植瘤以及鼻咽癌移植瘤的新生血管生成及細(xì)胞生長具有抑制作用〔1,2〕。本試驗(yàn)將自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)引入，進(jìn)一步探討自噬在貝伐單抗非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制中的作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549由河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室提供。貝伐單抗(阿瓦斯汀)購自瑞士羅氏制藥公司。3-MA、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、單丹磺酰尸胺(MDC)及吖啶橙(AO)為美國Sigma公司產(chǎn)品。AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI1640、不含乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶消化液購自Solarbio公司。微管相關(guān)蛋白(LC)-3及Beclin1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1MTT法定性檢測(cè)細(xì)胞存活與生長 用含10%胎小牛血清加1640培養(yǎng)基將A549細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔5 000～10 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，體積100 μl/孔，按5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞貼壁，加入濃度梯度的藥物，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，100 μl/孔,作用24～48 h。 每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔加150 μl DMSO，脫色搖床振蕩10 min，選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以5×105個(gè)/ml接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入相應(yīng)濃度藥物，設(shè)立陰性對(duì)照組并作用24 h。收集懸浮細(xì)胞，用不含EDTA胰蛋白酶消化液消化收集貼壁細(xì)胞，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入400 μl AnnexinV結(jié)合液懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/ml，在細(xì)胞懸液中加入5 μl AnnexinV-FITC染色液，混勻，4℃避光孵育15 min，再加10 μ PI，混勻，4℃避光孵育5 min，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.3AO及MDC染色檢測(cè)細(xì)胞自噬情況 將處于對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞，以5×105個(gè)/ml濃度接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，采用所測(cè)得最適實(shí)驗(yàn)濃度的貝伐單抗和3-MA處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組，作用24 h后棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次,加濃度為50 μmol/L的MDC(或10 μg/ml的AO)在5%CO2，37℃下染色45 min，棄染液，PBS洗滌3次，用4%多聚甲醛在4℃下固定15 min，后用PBS洗滌3次，立即用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞自噬的變化情況并攝片。

1.2.4Western 印跡檢測(cè)細(xì)胞Beclin1和LC-3蛋白的表達(dá) 選擇處于對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞若干培養(yǎng)瓶，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組：單用貝伐單抗，單用3-MA及聯(lián)用組，并設(shè)置空白對(duì)照組。分別加入實(shí)驗(yàn)濃度藥物，培養(yǎng)24 h。同時(shí)收集瓶中和培養(yǎng)液中的細(xì)胞，經(jīng)預(yù)冷PBS洗滌后，每瓶細(xì)胞加入裂解液,經(jīng)離心后分裝入EP管中。應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)，通過測(cè)定吸光度值進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。配置好分離膠及濃縮膠，每孔上樣15 μl，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜，并用5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加入Beclin1及LC-3抗體(濃度均為1∶500)4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗滌3次，10 min/次，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST再次洗滌4次，10 min/次，進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光，暗室內(nèi)X膠片曝光顯影并攝片。β-actin為內(nèi)參照。

2 結(jié) 果

2.1MTT結(jié)果 隨著貝伐單抗及3-MA濃度的增加，對(duì)A549細(xì)胞的抑制率也增加、貝伐單抗作用48 h時(shí)，細(xì)胞IC50值約為20 μmol/L，因此選用20 μmol/L作為貝伐單抗實(shí)驗(yàn)劑量；3-MA作用48 h時(shí)，A549細(xì)胞IC10值約為10 mmol/L,故選用10 mmol/L作為3-MA實(shí)驗(yàn)劑量。

2.2細(xì)胞凋亡情況 流式細(xì)胞儀檢測(cè)示，單用貝伐單抗組細(xì)胞凋亡率為(21.82±0.41)%，3-MA組細(xì)胞凋亡率為(3.54±0.11)%，二者與對(duì)照組(0.92±0.26)%相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率較單用貝伐單抗組和3-MA組均有增加，為(36.76±0.87)%(均P<0.05)。

2.3AO及MDC檢測(cè)細(xì)胞自噬情況 用熒光染料AO染色，檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酸性膜泡的變化，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)及胞核周圍出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)酸性囊泡。單用貝伐單抗組出現(xiàn)較多自噬空泡，說明貝伐單抗可誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)自噬現(xiàn)象；而3-MA組幾乎未見自噬空泡；對(duì)照組及聯(lián)用組出現(xiàn)自噬空泡數(shù)多于3-MA組，而少于貝伐單抗組，說明3-MA在一定程度上可以抑制貝伐單抗誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。見圖1。MDC多聚集在自噬空泡中，在細(xì)胞核周圍可見藍(lán)綠色或黃綠色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。單用貝伐單抗組A549細(xì)胞可見細(xì)胞中出現(xiàn)大量自噬空泡，說明該組細(xì)胞明顯發(fā)生自噬。而單用3-MA組細(xì)胞未見明顯自噬空泡，貝伐單抗與3-MA聯(lián)合組較單用貝伐單抗組細(xì)胞相比，自噬空泡有所減少。說明3-MA可以一定程度上抑制貝伐單抗誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。見圖2。

圖1 AO檢測(cè)細(xì)胞自噬情況(×400)

圖2 MDC檢測(cè)細(xì)胞自噬情況(×400)

2.4Western 印跡結(jié)果 貝伐單抗組Beclin1及LC-3表達(dá)較對(duì)照組均明顯增加，而貝伐單抗與3-MA聯(lián)合作用組中兩種蛋白的表達(dá)較單用貝伐單抗組明顯減少。MG132作用后，半胱氨酸蛋白酶(Caspase-9)的表達(dá)明顯增加，而加入3-MA聯(lián)合作用后，其表達(dá)較單用MG132明顯增加。見圖3。

圖3 Western 印跡檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

抗腫瘤血管治療是目前抗腫瘤治療的熱點(diǎn)，在正常組織中，血管或脈管系統(tǒng)的生成是受到嚴(yán)格調(diào)控的，但是，研究表明在大多數(shù)人類腫瘤中VEGF表達(dá)均上調(diào)。血管的生成涉及到血管內(nèi)皮細(xì)胞和其分泌的配體以及各種生長因子之間復(fù)雜的相互作用。其中，VEGF是介導(dǎo)血管生成最關(guān)鍵的因子之一。貝伐單抗是一種重組的人類單克隆IgG1抗體，通過抑制人類血管VEGF的生物學(xué)活性而起作用。

近年來，自噬作為Ⅱ型程序性死亡已經(jīng)越來越受到人們的重視。在自噬發(fā)生的早期，自噬可作為一種保護(hù)機(jī)制，使腫瘤細(xì)胞避免受到低營養(yǎng)、電離輻射和化療等所致的損傷而持續(xù)生存；而當(dāng)外部環(huán)境較差，腫瘤細(xì)胞過度自我吞噬效應(yīng)時(shí)，就會(huì)引起自噬性死亡(Ⅱ型程序性死亡)，從而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔3〕。作為抗腫瘤血管生成藥物，貝伐單抗可能存在刺激細(xì)胞過度自噬而抑制腫瘤細(xì)胞生長，甚至促進(jìn)其死亡的作用。另據(jù)研究〔4〕表明，3-MA作為特異性抑制自噬后通過激活凋亡特異性蛋白Caspase-3誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞啟動(dòng)程序性細(xì)胞死亡。

LC-3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母ATG8(Aut7/Ap98)基因的同源物，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的形成。LC-3有Ⅰ型和Ⅱ型之分。自噬發(fā)生時(shí)，Ⅰ型LC-3經(jīng)泛素樣加工修飾過程，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合，形成Ⅱ型LC-3。LC-3Ⅱ結(jié)合并始終位于胞內(nèi)自噬體的膜上。其含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少成正比〔5〕。因此LC-3的表達(dá)強(qiáng)度與自噬活性密切相關(guān)。

本試驗(yàn)AO及MDC后經(jīng)光學(xué)顯微鏡下觀察，均得出貝伐單抗有較弱的促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡作用，其機(jī)制可能為使腫瘤細(xì)胞過度自噬引起自噬性死亡；且與自噬抑制劑3-MA聯(lián)用時(shí)，較單用貝伐單抗有更強(qiáng)的促細(xì)胞凋亡的作用。最后通過蛋白免疫印跡雜交檢測(cè)微管相關(guān)蛋白LC-3及自噬相關(guān)蛋白beclin-1的表達(dá)變化，再次驗(yàn)證貝伐單抗的促進(jìn)A549細(xì)胞自噬及凋亡的作用。

4 參考文獻(xiàn)

1GuoXL,Li D，Sun K，etal.Inhibition of autophagy enhances anticancer effects of bevacizumab in hepatocarcinoma〔J〕.J Mol Med，2013；9(4)：473-83.

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3Mathew R,Karantza-wadsworth V,White E.Role of autophagy in caner〔J〕.Nat Rev Cancer,2007；7(12):961-7.

4朱良綱， 杭均彪， 杜海磊，等.自噬在吉西他濱誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549凋亡中的作用及其相關(guān)機(jī)制〔J〕.中國腫瘤臨床，2012；39(10)：652-5.

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