周 君 何紅晨 劉慧芳 郭 華 夏 璐 陳世菊 覃渝茜 何成奇

(四川大學(xué)華西醫(yī)院康復(fù)科 四川省康復(fù)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路涉及骨骼發(fā)育的各個方面，激活 Wnt/β-catenin信號通路能促進(jìn)成骨細(xì)胞始祖細(xì)胞增殖和分化，增加成骨細(xì)胞的活性，從而促進(jìn)新骨形成，增加骨密度〔1，2〕。骨質(zhì)疏松發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制可能涉及Wnt/β-catenin信號通路的改變〔3，4〕。本研究觀察去卵巢對SD大鼠Wnt/β-catenin信號通路中的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(LRP5)、β-catenin mNRA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料與設(shè)備 雙能X線骨密度測量儀(Dexa，美國)；奧林巴斯光學(xué)顯微鏡(日本)；Laica切片機(jī)(德國)；FTC2000實(shí)時熒光定量基因擴(kuò)增儀(Funglyn，加拿大)；雌二醇(E2)、骨源性堿性磷酸酶(BALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP5b)酶聯(lián)免疫法試劑盒(羅氏公司，美國)；LRP5單克隆抗體(Genetex ，美國)，β-catenin單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司，中國)；Trizol試劑(Invitrogen，美國)；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis kit (Fermentas，德國)，Taq DNA PCR反應(yīng)試劑盒(Takara,中國)，其余試劑均為市售分析純。3月齡未育雌性SD大鼠20只，由四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2方法

1.2.1分組與造模 實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于四川大學(xué)華西醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心，清潔級環(huán)境。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，按隨機(jī)數(shù)字表法把20只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常對照組和去勢組，每組10只。參照Gregory等〔5〕對去勢組大鼠施行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，術(shù)后每只大鼠肌肉注射青霉素4萬U，1次/d，連用3 d以預(yù)防感染。正常對照組大鼠不作任何處理。每只實(shí)驗(yàn)大鼠分籠飼養(yǎng)在溫度20℃～26℃，濕度60%～70%，12 h間隔照明自由攝食。

1.2.2標(biāo)本采集及處理 去勢手術(shù)后12 w，眼眶取血2 ml，室溫靜置2 h，低溫3 000 r/min離心15 min，每份分3次用移液管取上層血清約300～500 μl，分別置于3個1.5 ml EP管中，于-70℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3血清E2、BALP和TRACP5b檢測 采用ELISA，嚴(yán)格按照試劑說明書操作，測定血清E2、BALP和TRACP5b水平。

1.2.4骨密度測定 雙能X線骨密度測量儀測定實(shí)驗(yàn)動物左股骨骨密度。處死大鼠后，迅速取出左側(cè)股骨、剝離肌肉、生理鹽水沖洗,將股骨放在盛有深約2.5 cm的蒸餾水(用于模擬股骨周圍的軟組織)的容器中，用小動物軟件進(jìn)行掃描。

1.2.5LRP5及β-catenin mRNA的RT-PCR檢測 參照Trizol說明書，提取大鼠右股骨中骨髓的總RNA，參照試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR，采用β-actin作為內(nèi)參。LRP5引物上游：5′-GACATTTACTGGCCCAATGG-3′，引物下游5′-CTGCCCTCCACCACCTTCT-3′，引物間片段長131 bp；β-catenin：引物上游： 5′-GGAAAGCAAGCTCATCATTCT-3′，引物下游5′-AGTGCCT GCATCCCACCA-3′，引物間片段長171 bp；β-actin：引物上游5′-GCCAACACAGTGCTGTCT-3′，引物下游5′-AGGAGCAATGATCTTGATCTT-3′，引物間片段長114 bp。PCR反應(yīng)條件：①94℃ 2 min ②94℃ 20 s，55℃ 30 s，60℃ 40s，共45個循環(huán)。根據(jù)動力學(xué)曲線確定每個樣品管中熒光強(qiáng)度增加到某一特定閾值時的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct值)，將原始數(shù)據(jù)(Ct值)換算為基因的相對表達(dá)量(2-ΔΔCt)用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6Western印跡檢測 取大鼠右股骨中骨髓100 mg提取蛋白， SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳， 并將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上； 分別加入LRP5及β-catenin單克隆抗體，4℃孵育過夜；二抗常溫下孵育2 g行DAB顯色和定量分析，利用圖像分析軟件測定電泳條帶的光密度值，目的蛋白相對定量值=目的蛋白條帶光密度值/β-actin蛋白條帶光密度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件行組t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1血清E2、BALP和TRACP5b水平 手術(shù)后12 w去勢組血清E2水平為(23.94±6.69)pg/ml，比正常對照組(42.70±12.48)pg/ml顯著降低(P<0.01)；去勢組的血清BALP水平為(108.50±7.23)U/L，比正常對照組(91.30±7.31)U/L顯著增加(P<0.01)；去勢組的血清TRACP5b水平為(12.92±2.94)U/L，比正常對照組(8.54±2.33) U/L顯著增加(P<0.01)。

2.2骨密度檢測 手術(shù)后12 w去勢組的左股骨密度 (0.242±0.020) g/cm2,比正常對照組(0.281 ±0.021)g/cm2下降13.9%(P<0.01)。

2.3RT-PCR檢測 去勢組β-catenin mRNA表達(dá)(2.49±0.84)比正常對照組(1.14±0.65)顯著增高(P<0.05)，盡管去勢組LRP5 mRNA表達(dá)(1.62±0.94)比正常對照組(1.05±0.33)高，但兩組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4Western印跡檢測 去勢組β-catenin 蛋白表達(dá)(0.31±0.13)比正常對照組(0.21±0.05)顯著增高(P<0.05)，盡管去勢組LRP5 蛋白表達(dá)(0.31±0.13)比正常對照組(0.20±0.03)高，但兩組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 兩組大鼠骨髓中LRP5和β-catenin 蛋白的表達(dá)

3 討 論

Wnt/β-catenin信號通路是一種進(jìn)化非常保守的信號通路，從低等生物到高等哺乳動物都廣泛存在，在生物發(fā)育、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞凋亡等生命過程中發(fā)揮重要作用并且與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)〔6〕，Wnt/β-catenin信號通路還可以通過干細(xì)胞更新、促進(jìn)成骨細(xì)胞始祖細(xì)胞增殖和分化、誘導(dǎo)成骨細(xì)胞發(fā)生、抑制成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡等機(jī)制，促進(jìn)新骨形成，增加骨密度〔2〕。經(jīng)典Wnts信號通路的細(xì)胞分子包括Wnts、LRP5、β-catenin和T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子(TCF/LEF)等。

LRP5是成骨細(xì)胞膜上Wnts的輔助受體；能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)一系列的信號傳遞，在骨骼系統(tǒng)發(fā)育和維持骨量的過程中起到重要作用。在人類功能缺失的LRP5基因突變導(dǎo)致以骨密度降低為特點(diǎn)的骨質(zhì)疏松癥-假神經(jīng)膠質(zhì)瘤綜合征的發(fā)生,而功能獲得性LRP5基因突變引起骨密度增加〔3〕。

β-catenin是一種鈣黏蛋白，它直接與鈣黏素和肌動蛋白細(xì)胞支架連接，對細(xì)胞黏附和遷移很重要，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和生存，是Wnt/β-catenin 信號通路的重要組成部分〔7〕，是經(jīng)典Wnts信號通路激活的必要條件〔8〕，在有Wnts信號存在時，Wnts信號通過蛋白Disheveled、軸蛋白(Axin)和Frat-1傳遞至抑制β-catenin的蛋白質(zhì)復(fù)合物(APC)，Axin和糖原合成酶激酶3(GSK3)并抑制GSK3的活性，釋放β-catenin，從而β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)聚集并進(jìn)行核轉(zhuǎn)位，在核內(nèi)，它與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子相互作用，介導(dǎo)Wnts對基因轉(zhuǎn)錄的多種效應(yīng)〔1，2，9〕。本研究結(jié)果提示去勢大鼠Wnt/β-catenin信號通路被激活，基于β-catenin在骨形成的重要作用〔8〕，推斷去卵巢促進(jìn)了大鼠新骨的形成，這從去勢大鼠的血清BALP顯著增高得到證實(shí)，因?yàn)锽ALP反映成骨細(xì)胞活性，可以作為骨形成的生化指標(biāo)〔10〕。但是去勢大鼠的骨密度總趨勢是下降的，這是因?yàn)槿莺螅萍に亟档蛯?dǎo)致骨吸收增加，在本研究結(jié)果說明大鼠去勢后骨吸收增加，骨吸收大于骨形成最終導(dǎo)致骨密度下降。本研究結(jié)果說明去卵巢12 w后大鼠Wnt /β-catenin信號通路被激活，在去勢大鼠骨組織代謝和骨重建過程中起到重要作用。然而一項(xiàng)研究〔11〕發(fā)現(xiàn)大鼠去卵巢4 w和8 w后Wnt /β-catenin信號通路被抑制。究其原因，Wnt/β-catenin信號通路在去勢大鼠中的功能狀態(tài)可能與去卵巢的時間有關(guān)。

本研究提示β-catenin介導(dǎo)的經(jīng)典Wnts信號通路被激活。Wnt /β-catenin信號通路作為促進(jìn)骨形成機(jī)制的核心〔4〕，該通路所涉及的靶位或因子有望成為開發(fā)新的抗骨質(zhì)疏松藥物的潛在作用位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)〔12〕電針足三里、三陰交能促進(jìn)去勢大鼠LRP5、β-catenin的表達(dá)，激活Wnt /β-catenin信號通路，從而增加骨密度。然而，由于該信號通路參與了很多基本的生命過程，如胚胎的發(fā)生、組織器官的生成等〔13，14〕，而且此通路的激活與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)〔6，15，16〕，因而通過激活Wnt/β-catenin信號通路的機(jī)制來治療骨質(zhì)疏松的靶向藥物及各種治療方法的安全性和副作用，需深入研究和全面評估。

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