周 濤 向道康 秦國(guó)偉 謝曉勇

(貴州省人民醫(yī)院心臟外科，貴州 貴陽(yáng) 550002)

臨床上心肌缺血再灌注損傷常發(fā)生在缺血心肌血運(yùn)得到恢復(fù)以后〔1，2〕，如心臟冠脈介入治療、冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)、某些手術(shù)中需要阻斷主動(dòng)脈而冠狀動(dòng)脈無(wú)血液灌注的體外循環(huán)心內(nèi)直視手術(shù)后，術(shù)中的心肌保護(hù)是提高治療效果的關(guān)鍵；老年患者心肌由于本身結(jié)構(gòu)和代謝特點(diǎn)更易損傷，因此如何減少老年心肌的缺血再灌注損傷有一定的現(xiàn)實(shí)意義。左卡尼汀是細(xì)胞能量代謝過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)因子，對(duì)心肌能量代謝的調(diào)節(jié)具有重要的作用。作者早期的研究結(jié)果表明〔3〕體外循環(huán)心內(nèi)直視手術(shù)中使用添加LCN的心臟停搏液對(duì)心肌細(xì)胞有較好的保護(hù)效果，進(jìn)一步研究提示添加LCN的心臟保存液可以明顯減輕冷保存大鼠心肌線粒體的鈣超載，減輕心肌的氧化損傷，可以改善心肌的能量代謝，提高低溫離體心臟的保存效果〔4〕。因此，理論上LCN可以減輕老年患者心肌的缺血再灌注損傷，但目前少有這方面的研究，現(xiàn)利用Langendorff 灌注裝置建立老年大鼠離體心臟缺血再灌注模型，探討添加LCN的St.Thomas No.2液對(duì)老年大鼠離體心臟再灌注損傷的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型的建立 使用隨機(jī)數(shù)字表法將24只健康雄性S-D老年大鼠(月齡20個(gè)月)隨機(jī)分成3組：對(duì)照組、LCN1組與LCN2組，每組 8只，其中對(duì)照組使用 St.Thomas No.2 液，St.Thomas No.2 液主要成分(mmol/L)：氯化鈉 120、氯化鉀 16、氯化鎂 16.6、氯化鈣1.2、碳酸氫鈉10，pH7.8，作為心臟停搏液，LCN1組、 LCN2組分別按6 g/L、12 g/L 添加LCN于St.Thomas No.2液為心臟停搏液，其他處理三組相同。

模型建立參考文獻(xiàn)〔4〕，老年大鼠稱(chēng)重，肝素鈉腹腔注射抗凝，烏拉坦麻醉平穩(wěn)后胸骨正中入胸，摘除心臟置入 4℃的 Krebs-Henseleit (K-H)緩沖液中，K-H 緩沖液主要成分(mmol/L)為氯化鈉 118.5、氯化鉀 4.8、硫酸鎂 1.2、氯化鈣1.8、碳酸氫鈉25、磷酸二氫鉀1.2，pH7.4，使用時(shí)新鮮配制，并經(jīng)48 μm的過(guò)濾器過(guò)濾，灌注前給予95% O2和5% CO2混合氣體按 1.5 L/min向儲(chǔ)液瓶?jī)?nèi)的灌流液中通氣30 min。離體心臟修剪后與 Langendorff 裝置連接， K-H 緩沖液以灌注壓維持在90 cmH2O壓力、37℃恒溫灌流進(jìn)行灌注，為使冠狀動(dòng)脈回流液充分引流肺動(dòng)脈根部切開(kāi)。平衡15 min左右心臟搏動(dòng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，血流動(dòng)力學(xué)平穩(wěn)后測(cè)定血流動(dòng)力學(xué)相關(guān)指標(biāo)值，逐漸降低灌注溫度至 30℃以下，按分組經(jīng)主動(dòng)脈根部分別灌注不同的心臟停搏液使心臟停搏(停搏液溫度為4℃，劑量80 ml/kg，灌注壓力70 cm H2O,約3 min)，取下停搏心臟，根據(jù)分組不同在相應(yīng)的心臟保存液中分別保存30 min，重新開(kāi)始心臟灌注。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 使用Langendorff離體心臟灌流裝置、PowerLab多導(dǎo)生理記錄儀(美國(guó)AD Instruments公司ML870型)、高效液相色譜儀(法國(guó) Gilson 公司)和全自動(dòng)生化分析儀(日立公司7170A型)；丙二醛(MDA)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；LCN(商品名貝康亭)廣州貝氏藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.3標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè) 在灌注恢復(fù)30 min、60 min后測(cè)定各血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)值，包括心率(HR)、冠脈流量 (CF)、左心室收縮峰壓 (LVSPP)與左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)，各項(xiàng)指標(biāo)的恢復(fù)率按(保存后數(shù)值/保存前數(shù)值)×100%計(jì)算；灌注恢復(fù)30 min后取冠脈流出液測(cè)定流出液中心肌酶乳酸脫氫酶(LDH)及磷酸肌酸激酶(CK)含量，LDH及CK使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定；心臟灌注恢復(fù)60 min后取左心室心肌組織，心肌組織勻漿后使用高效液相法檢測(cè)三磷酸腺苷(ATP)含量和硫代巴比妥法測(cè)定MDA含量。

2 結(jié) 果

2.1心臟恢復(fù)灌注30 min、60 min時(shí)心功能指標(biāo)的變化 心臟灌注30 min時(shí)各組比較HR、CF、LVSPP和+dp/dtmax恢復(fù)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。心臟灌注60 min時(shí)：LCN1組LVSPP恢復(fù)率較對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，HR、CF和+dp/dtmax恢復(fù)率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，LCN2組HR、CF、LVSPP和+dp/dtmax恢復(fù)率較LCN1組和對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組心功能指標(biāo)的變化比較

2.2心臟停搏前與恢復(fù)灌注30 min、60 min時(shí)心臟冠脈流出液心肌心肌酶比較 三組離體心臟冠脈流出液心肌酶CK、LDH濃度在停搏前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；心臟復(fù)跳30 min、60 min時(shí)比較三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中對(duì)照組漏出量最多(P<0.05)，LCN2組和LCN1組間比較，LCN1組較LCN2組漏出量較多(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組心臟各時(shí)間點(diǎn)心肌酶漏出量比較

2.3心臟復(fù)灌60 min時(shí)心肌ATP、MDA比較 心臟復(fù)灌60 min時(shí)對(duì)照組、LCN1 和LCN2組心肌ATP依次為(1.38±0.53)、(2.06±0.79)、(2.93±0.82)μmol/g；MDA含量對(duì)照組、LCN1 和LCN2組依次為(3.09±0.67)、(2.32±0.49)、(2.06±0.41)nmol/mg，LCN1組 、LCN2組與對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，LCN1組、LCN2組間比較差別亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

LCN廣泛分布于機(jī)體各種組織細(xì)胞中，是細(xì)胞能量代謝的重要調(diào)節(jié)因子，其作用是攜帶長(zhǎng)鏈脂酰CoA通過(guò)線粒體內(nèi)膜，促進(jìn)三羧酸循環(huán)的正常進(jìn)行，協(xié)助細(xì)胞維持生理活動(dòng)所需的能量生成，對(duì)心肌代謝途徑的調(diào)節(jié)具有非常重要的作用。對(duì)于老年心臟而言，本身具有與年輕心臟不同的心肌結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及可能存在的能量代謝障礙，更易遭受心肌缺血再灌注損傷，有較多研究表明LCN對(duì)于缺血再灌注組織的氧化應(yīng)激有較好的減輕作用〔5〕，因此理論上LCN作為參與組織細(xì)胞能量代謝的重要物質(zhì)對(duì)缺血再灌注老年心肌可能有一定的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立離體心臟再灌注模型，觀察添加LCN對(duì)老年大鼠離體心臟的作用，以觀察LCN可否減輕對(duì)老年心肌的缺血再灌注損傷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，較大劑量LCN組可明顯加快恢復(fù)灌注離體心臟HR、CF、LVSPP和+dp/dtmax等指標(biāo)的恢復(fù)，減少心肌酶的漏出量，表明LCN添加入經(jīng)典的 St.Thomas No.2液配方中可以減輕老年離體心臟再灌注時(shí)心肌的損傷，改善心臟功能，心肌結(jié)構(gòu)和心臟功能可以得到較好的保護(hù)，顯示出對(duì)老年大鼠離體心臟更好的保護(hù)效果；但同時(shí)本研究表明，添加較小劑量的LCN組心臟恢復(fù)灌注60 min時(shí)對(duì)心臟功能多數(shù)指標(biāo)以及添加LCN二組在心臟灌注恢復(fù)30 min時(shí)對(duì)心臟功能指標(biāo)恢復(fù)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明LCN的保護(hù)效果與再灌注時(shí)間和LCN使用劑量有關(guān)，值得進(jìn)一步研究；但是心臟復(fù)跳30 min、60 min時(shí)比較三組間心肌酶譜漏出量以對(duì)照組最多，小劑量組較大劑量組較多，表明心肌酶譜比心功能恢復(fù)率更好地評(píng)價(jià)LCN對(duì)心肌的保護(hù)效果，同時(shí)證明LCN對(duì)缺血再灌注老年心肌的保護(hù)作用有劑量依賴(lài)性，但其最佳劑量尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

心肌缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制之一是自由基的影響〔6〕，再灌注過(guò)程中氧自由基產(chǎn)生增加，攻擊細(xì)胞內(nèi)不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，MDA是該反應(yīng)過(guò)程的中間代謝產(chǎn)物，而且MDA的產(chǎn)生與脂質(zhì)過(guò)氧化相平行，可反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度，其水平高低可間接反映細(xì)胞受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度。已有研究證實(shí)，LCN作為一種有效的氧自由基清除劑，在緩解氧化應(yīng)激、減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)中均具有明顯的保護(hù)效果。本研究表明，LCN可以使再灌注心臟MDA產(chǎn)生減少，表明LCN可作為氧自由基清除劑減輕保存離體老年心臟恢復(fù)灌注時(shí)自由基損傷，可能是LCN減輕老年大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的重要原因之一。同時(shí)，目前認(rèn)為心肌缺血再灌注損傷另一重要因素是再灌注心肌存在能量代謝障礙，LCN是人體能量代謝中必需的天然物質(zhì)，在心肌的能量代謝中起重要作用〔7〕，線粒體是細(xì)胞氧化磷酸化和能量產(chǎn)生的重要場(chǎng)所，是心肌細(xì)胞獲得ATP最重要的來(lái)源，線粒體功能是心肌損傷的重要標(biāo)志〔8〕,LCN可以促進(jìn)線粒體呼吸功能的恢復(fù)〔3〕，改善缺血再灌注時(shí)的能量代謝障礙，優(yōu)化心肌細(xì)胞能量代謝，減少缺血再灌注損傷，而且LCN可減輕長(zhǎng)時(shí)間冷保存心肌線粒體鈣超載〔4〕，改善線粒體呼吸功能，減輕ATP的降低，改善心肌能量代謝，對(duì)心肌細(xì)胞線粒體有較好的保護(hù)作用〔9〕，因此，在本實(shí)驗(yàn)中心臟停搏液中添加LCN可能有助于離體老年大鼠心臟能量代謝平衡，減少后續(xù)的心肌缺血再灌注損傷，從而具有心肌保護(hù)效果。

因此，LCN可以減輕老年大鼠離體心臟缺血再灌注過(guò)程中自由基損傷，改善心肌能量代謝，減輕缺血再灌注損傷，對(duì)心肌細(xì)胞有較好的保護(hù)作用，同時(shí)該保護(hù)作用與LCN使用劑量和再灌注時(shí)間有關(guān)。

4 參考文獻(xiàn)

1Sanada S，Komuro I，Kitakaze M.Pathophysiology of myocardial reperfusion injury：preconditioning，postconditioning，and translational aspects of protective measures〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011；301(5)：H1723-41.

2Hedstr?m E，Astr?m-Olsson K，Ohlin AK,etal.Initial results of inflammatory response，matrix remodeling，and reactive oxygen species following PCI in acute ischemic myocardial injury in man〔J〕.J Invasive Cardiol，2011；23(9):371-6.

3向道康,閻興治,楊世虞,等.左卡尼汀對(duì)體外循環(huán)心瓣膜替換術(shù)心肌的保護(hù)作用〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2003；83(21)：1887-90.

4周 濤,向道康,秦國(guó)偉.左卡尼汀強(qiáng)化St.Thomas No.2液對(duì)長(zhǎng)時(shí)間冷保存離體心 臟能量代謝的影響〔J〕.中國(guó)心血管病研究，2010；8(11)：851-4.

5Augustyniak A，Skrzydlewska E.L-Carnitine in the lipid and protein protection against ethanol-induced oxidative stress〔J〕.Alcohol，2009；43(3)：217-23.

6Liao PH，Hung LM，Chen YH,etal.Cardioprotective effects of luteolin during ischemia-reperfusion injury in rats〔J〕.Circ J，2011；75(2)：443-50.

7Makrecka M，Kuka J，Liepinsh E,etal.The regulation of mitochondrial energy metabolism by L-carnitine lowering agents in ischaemia-reperfusion injury〔J〕.Heart，2011；97(24):e8.

8Alves MG,Oliveira PJ，Carvalho RA.Mitochondrial preservation in celsior versus histidine buffer solution during cardiac ischemia and reperfusion〔J〕.Cardiovasc Toxicol，2009；9(4):185-93.

9Oyanagi E,Yano H,Kato Y,etal.L-Carnitine suppresses oleic acid-induced membrane permeability transition of mitochondria〔J〕.Cell Biochem Funct，2008；26(7)：778-86.