師迎旭 杜 華 鄭國光

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所，天津 300020)

體外細胞培養(yǎng)法常被用于細胞功能性的相關(guān)研究。衰老的起因是由于分子水平上的改變，檢測其分子水平上的變化對于鑒定細胞是否衰老十分重要。檢測細胞衰老的指標有β-半乳糖苷酶染色(SA-β-cal)〔1,2〕、端粒長度檢測〔3,4〕、端粒DNA 3＇突出端的長度檢測〔5,6〕、α2巨球蛋白(α2M)〔7〕、p16INK4a〔8,9〕、p21WAF-1〔10,11〕表達水平等。還可以通過檢測細胞周期來判定細胞的衰老，衰老細胞會停滯于G1期，但停滯于G1期的細胞并不一定會衰老也可能會進入靜息期〔12〕。β-半乳糖苷酶隨著細胞衰老表達逐漸增高，由此SA-β-cal作為一個最常用的、方便的細胞衰老生物學(xué)檢測方法。端粒長度隨細胞衰老而縮短，端粒長度的檢測也是判定復(fù)制性衰老的一個重要指標。p21WAF-1在衰老細胞中高表達，而且p21WAF-1還參與細胞周期調(diào)控以及p53/ATM信號通路，檢測p21WAF-1的表達可在細胞衰老與細胞周期調(diào)控以及信號通路之間建立聯(lián)系，為進一步研究衰老的發(fā)生、發(fā)展提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1分離培養(yǎng)人胚肺成纖維(HEL)細胞 選用4月齡的未經(jīng)藥物處理過的女性胚胎，在無菌操作臺內(nèi)將肺臟組織取出，用磷酸鹽緩沖液(PBS)將其沖洗干凈。將組織切割成1 mm3左右的小塊，用眼科鑷均勻鋪于事先準備好的培養(yǎng)皿內(nèi),加入少量含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，以組織塊不在培養(yǎng)液內(nèi)漂浮為宜，然后把培養(yǎng)皿放置在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)。放置2～4 h后待組織小塊貼附于培養(yǎng)皿，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃含5%的CO2的條件下培養(yǎng)，待1～2 d后細胞由組織中游出，摘掉組織塊并用PBS清洗培養(yǎng)皿去除死細胞和組織殘留物，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待培養(yǎng)皿中的細胞長滿后用胰蛋白酶將其消化下來，轉(zhuǎn)入50 ml的塑料培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，此時的細胞我們稱其為原代HEL細胞。

1.2HEL細胞的純化 組織內(nèi)的細胞都是混雜生長的，因人胚肺組織內(nèi)主要由成纖維細胞構(gòu)成，還含有個別其他類型的細胞，進行組織培養(yǎng)后可見游離出的細胞幾乎全部都是成纖維細胞，利用成纖維細胞的增殖優(yōu)勢，可排擠其他細胞的生長，通過胰蛋白酶消化傳代，靠自然的增殖潛力最后留下生長優(yōu)勢細胞——HEL細胞，達到細胞純化的目的。

1.3HEL細胞培養(yǎng)傳代 細胞生長融合達到約80%～90%，胰蛋白酶消化，按1∶2分瓶進行傳代。每次傳代時所鋪細胞計為N0，當(dāng)細胞再次生長融合達到約80%～90%時收獲細胞并計數(shù)此時的細胞數(shù)記為NH，經(jīng)公式(PD=3.32×logNH/N0)〔13〕計算每一次傳代的PD。培養(yǎng)基為DMEM，添加10%的新生牛血清與1/1 000的青鏈霉素(20萬U/ml)。在37℃，濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.4HEL細胞復(fù)制性衰老檢測

1.4.1HEL細胞SA-β-Gcal半乳糖苷酶染色〔1,2〕選用培養(yǎng)不同培養(yǎng)代齡(PD)的HEL細胞，用胰蛋白酶消化細胞，細胞計數(shù)，鋪24孔板，每孔約9×103個細胞，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。然后固定細胞，加入染色液X-gal。培養(yǎng)箱中孵育過夜，陽性細胞被染成藍色。顯微鏡觀察，并進行照相。

1.4.2測定HEL細胞的端粒長度〔3,4〕①寡核苷酸探針(TTAGGG)標記，用T4 PNK標記探針，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?②提取HEL細胞的基因組DNA,培養(yǎng)HEL維細胞至PD為21、29、36、44、51、59，收集約106～108個細胞，離心棄上清,裂解細胞。加入蛋白酶K至終濃度為100 μg/ml，于50℃水浴中孵育3 h。進行酚氯仿抽提。加入異丙醇于-20℃沉淀過夜。離心棄上清。用75%乙醇洗沉淀，離心棄上清，室溫干燥。加入TE溶解沉淀。測定基因組DNA的濃度。③用EcoR I 酶切不同PD的HEL基因組DNA各5 μg，于37℃酶切過夜。酶切后進行電泳。采用毛細管虹吸轉(zhuǎn)移法將DNA片段轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。紫外交聯(lián)固定，然后放入雜交管內(nèi)，加入雜交液。37℃預(yù)雜交3 h，加入標記好的探針37℃雜交過夜。洗膜，放射顯影。

1.5Western印跡檢測HEL細胞衰老過程中的p21WAF-1蛋白表達量 ①收獲并裂解HEL細胞：在細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加入RIPA裂解液裂解細胞，將裂解物超聲破碎。超聲破碎后，冰浴30 min。4℃離心，收集上清。采用Bradford法檢測蛋白濃度。②SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜與雜交:每一樣品取等量的蛋白進行10%SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后將SDS-PAGE切割成合適的大小，恒流，根據(jù)p21WAF-1蛋白分子量的大小轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后封閉膜2 h。封閉結(jié)束后加入p21WAF-1一抗，室溫作用2 h，4℃繼續(xù)作用過夜，洗膜。再加入HRP二抗作用2 h，洗膜。加化學(xué)發(fā)光底物于膜上，檢測目的蛋白的表達。

2 結(jié) 果

2.1HEL細胞復(fù)制性衰老細胞模型的建立 每傳一代的PD值，累計算出最終PD為64。在培養(yǎng)過程中對細胞形態(tài)進行觀察，后期培養(yǎng)的細胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，細胞輪廓變得不再鮮明，細胞變粗、變大、形態(tài)不規(guī)則，細胞質(zhì)內(nèi)黑色顆粒增多，細胞在培養(yǎng)后期生長緩慢，倍增時間延長，表明細胞分裂增生能力下降，細胞周期延長。相比之下，前期細胞輪廓鮮明,呈纖維樣，細胞細長,伸展能力強，細胞質(zhì)清晰透明，細胞生長旺盛。細胞形態(tài)上的變化顯示HEL細胞發(fā)生了細胞衰老。

2.2HEL細胞復(fù)制性衰老細胞模型的分子水平驗證

2.2.1不同PD的HEL細胞SA-β-Gal結(jié)果 可觀察到隨著HEL細胞PD的增加，細胞被藍染的個數(shù)及程度明顯增加。HEL細胞從PD29開始被藍染，PD44之后細胞被藍染程度加深，到PD51時所有細胞都被成染色藍，表明細胞衰老。此外，通過SA-β-Gal染色可對不同PD的HEL細胞進行形態(tài)學(xué)觀察，隨著HEL細胞的PD增加，細胞形態(tài)明顯變的粗大且不伸展，細胞輪廓模糊不清晰；相反早期的細胞輪廓清晰，細胞細長呈纖維樣。在PD36時，HEL細胞開始變的粗大，但仍保持纖維樣。PD44之后，細胞的外形發(fā)生明顯的變化，不能繼續(xù)維持纖維樣的外形，細胞變得不伸展，每個細胞的輪廓模糊不清晰。形態(tài)學(xué)的比較證明細胞發(fā)生了衰老。見圖1。

2.2.2HEL細胞衰老過程中端粒長度的變化 隨著HEL細胞的PD增加，細胞內(nèi)的短DNA的量也明顯增加，表明衰老造成短基因組DNA的片段增加了，基因組DNA的不穩(wěn)定性增加了。隨著HEL細胞PD的增加和細胞的衰老，端粒長度不斷變短。因單個染色體的端粒長度不相同，所以得到的條帶為smear帶。隨著PD的增加短端粒的數(shù)量明顯增加，表明隨著HEL細胞的衰老其端粒不斷縮短。見圖2。

PD21、PD29、PD36、PD44、PD5分別代表第21、29、36、44、51代HEL細胞，下圖同

A：EcoR Ⅰ酶切基因組DNA后的瓊脂糖電泳圖，圖中M1為Hind Ⅲ，M2為 DL-2000；B:Southern印跡檢測端粒長度

2.2.3不同PD的HEL細胞p21WAF-1蛋白表達檢測結(jié)果 p21WAF-1的蛋白表達水平與細胞衰老密切相關(guān)，它伴隨著細胞的衰老表達量逐漸增加，在PD44之前p21WAF-1的蛋白表達水平呈梯度上升。PD44之后p21WAF-1的蛋白表達水平增加程度減弱,表達水平趨于一平臺，說明HEL細胞在PD44時進入衰老狀態(tài)。

A：p21WAF-1，B：β-actin

3 討 論

對生物衰老的研究，其中心問題之一就是體外衰老是否與生物體衰老有聯(lián)系，用體外培養(yǎng)的細胞進行研究是否與生物的整體相關(guān)。也就是說，體外細胞衰老過程的研究是否有助于闡明體內(nèi)衰老的基本過程。Hayflick證實人二倍體成纖維細胞在體外培養(yǎng)時,隨體外培養(yǎng)所傳代數(shù)的增加,細胞的增殖能力逐漸喪失。此后，發(fā)現(xiàn)衰老現(xiàn)象不是細胞培養(yǎng)的人為產(chǎn)物，除了最早發(fā)現(xiàn)的人二倍體成纖維細胞，許多人類其他細胞也存在衰老現(xiàn)象，如表皮角質(zhì)細胞、T淋巴細胞等，這些都提示了體外復(fù)制衰老也是由遺傳控制的。體外培養(yǎng)細胞衰老與體內(nèi)衰老的另一個共同特征是端粒長度的縮短?？傊?，體外培養(yǎng)的細胞其復(fù)制衰老作為研究生物整體衰老的模型是可行的，而且是有用和有效的。目前，成纖維細胞體外增殖能力作為衰老生物學(xué)標志,廣泛用于衰老研究,成為衰老研究的重要工具。

人們通常采用化學(xué)損傷或氧化損傷的極端方法誘使細胞迅速衰老，但這一過程不能夠完全模擬正常細胞的衰老過程，這只能反映出一種應(yīng)急狀態(tài)下的細胞衰老現(xiàn)象。細胞衰老是一個非常復(fù)雜的過程，簡單的比較衰老細胞與年輕細胞的基因表達情況并不能深刻的揭示細胞衰老的機制。只有研究細胞衰老過程中不同PD細胞的基因表達情況，才可以在不同的層次上揭示細胞衰老的機制，確定衰老復(fù)合調(diào)控的基因群，尋找明確的衰老標志，發(fā)現(xiàn)衰老相關(guān)疾病的新靶點。因此，模擬正常細胞衰老過程的模型可能會更好的用于研究細胞衰老這一生命現(xiàn)象。

衰老細胞的形態(tài)變化主要表現(xiàn)在細胞皺縮，膜通透性、脆性增加，核膜內(nèi)折，細胞器數(shù)量特別是線粒體數(shù)量減少，胞內(nèi)出現(xiàn)脂褐素等異常物質(zhì)沉積，最終出現(xiàn)細胞凋亡或壞死?？傮w來說老化細胞的各種結(jié)構(gòu)呈退行性變化。但這些細胞形態(tài)上的變化只是表面現(xiàn)象。

根據(jù)Hayflick證實成纖維細胞可分裂40～50次，細胞形態(tài)及細胞周期均發(fā)生變化，導(dǎo)致細胞衰老。理論上PD64已是一衰老細胞。本研究發(fā)現(xiàn)細胞的倍增能力下降、倍增時間增長。通過端粒長度測定進一步證實隨著細胞的不斷分裂增殖端粒DNA長度明顯縮短，表明端粒長度是與細胞復(fù)制性衰老的確是密切相關(guān)的。由p21WAF-1的表達量可以進一步證實人胚肺細胞發(fā)生了細胞衰老，而且可以看出在PD44時細胞進入衰老狀態(tài)，因為此后的p21WAF-1表達量趨于一平臺，p21WAF-1在細胞衰老后增加量是趨于一平臺的。通過這些驗證試驗可以進一步確定成功建立了細胞復(fù)制性衰老模型。

衰老是生物體的一個復(fù)雜過程。衰老細胞的表型在細胞生活史中是獨特而穩(wěn)定的。衰老細胞的細胞周期穩(wěn)定的、不可逆的阻滯于G1期，喪失了對有絲分裂原的反應(yīng)能力，不能進行DNA合成，不能進入S期，細胞形態(tài)及功能均發(fā)生變化。但仍能維持代謝活動，HEL細胞衰老時不易凋亡。細胞衰老與端粒密切相關(guān)，端粒的長度可由端粒酶調(diào)控，可通過在HEL細胞中表達hTERT建立衰老與癌變的聯(lián)系。復(fù)制性衰老模型的建立不僅可用于研究細胞衰老，還可用于研究細胞凋亡、癌變在細胞生長、衰老過程中的可發(fā)生性，為在實踐中抗衰老和治療腫瘤提供新的材料基礎(chǔ)。本實驗成功建立了HEL細胞衰老模型，為進一步研究正常細胞復(fù)制性衰老的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

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