鐘勇，江時(shí)森，王俊，邵加慶，盧斌，顧萍

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院1.干部保健科，2.心臟內(nèi)科，3.內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210002)

2型糖尿病患者常合并有脂代謝異常，單純控制血糖不能完全消除糖尿病患者發(fā)生冠心病等大血管并發(fā)癥，因此，在控制血糖的同時(shí)，必須進(jìn)行調(diào)脂治療。研究[1]表明，在合并血脂代謝異常的2型糖尿病患者中，大劑量他汀藥物治療可能會(huì)影響患者的血糖控制。依折麥布作為第一種選擇性膽固醇吸收抑制劑，可單獨(dú)或與他汀類藥物聯(lián)合用于治療2型糖尿病合并高脂血癥。臨床研究表明，依折麥布不僅可降低血脂，同時(shí)可以改善2型糖尿病患者的糖代謝紊亂[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)依折麥布可以降低胰島素抵抗肥胖大鼠空腹胰島素水平及改善高脂誘導(dǎo)的糖耐量異常，但機(jī)制尚不完全明確[3]。本研究從依折麥布對(duì)db/db糖尿病小鼠胰島自身胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響來(lái)探討依折麥布降血糖的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及材料

40只8周齡清潔級(jí)雄性db/db小鼠，來(lái)自南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，體重35～48 g，隨機(jī)分為兩組，每組20只：db/db依折麥布治療組(依折麥布組)予6周的依折麥布(益適純，MSP Singapore Company LLC)10 mg·(kg·d)-1，db/db安慰劑對(duì)照組(db/db對(duì)照組)予安慰劑(5%阿拉伯膠。另20只同周齡同窩出生的db/m小鼠為非糖尿病對(duì)照組(db/m對(duì)照組)。動(dòng)物的處置均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物看護(hù)原則。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)儀Bioshine購(gòu)自上海歐翔科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生理生化指標(biāo)檢測(cè) 每周監(jiān)測(cè)體重和血糖，投藥前和投藥6周后測(cè)定空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、空腹總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、空腹胰島素(fasting serum insulin，F(xiàn)SI)水平，血糖測(cè)定使用強(qiáng)生公司生產(chǎn)的One-Touch 血糖儀。血漿胰島素測(cè)定使用小鼠胰島素ELISA試劑盒(Morinaga，Yokohama，Japan)。胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)的計(jì)算采用公式：ISI=ln1/(FBS×FSI)。

1.2.2 胰島分離及勻漿化 苯巴比妥麻醉后，夾閉膽總管十二指腸乳頭開口，膽總管穿刺注射1 g·L-1Ⅳ型膠原酶2 ml，迅速分離胰腺置于含Ⅳ型膠原酶的Hank平衡液中消化40 min，振蕩洗滌后分離胰島。然后將分離的胰島組織勻漿化。

1.2.3 胰島素負(fù)性調(diào)節(jié)因子蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的測(cè)定 按上述方法提取胰島，將分離的胰島勻漿化，經(jīng)PBS洗2次，使用細(xì)胞溶解液(加入1 mmol·L-1的PMSF)消化1 h，離心15 min(4 ℃、12 000×g)，采取上清液放入-80 ℃中保存?zhèn)溆谩５鞍踪|(zhì)印跡法檢測(cè)PTP1B含量變化。100 μg細(xì)胞溶解物SDS-PAGE 蛋白分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在室溫用PBS液溶解5%脫脂牛奶封膜1 h。加入羊抗鼠PTP1B多克隆抗體(工作濃度1∶4 000)4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(工作濃度1∶5 000)分別37 ℃孵育1 h，TBST洗3次。充分洗滌后與ECL(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑，英國(guó)Amersham)反應(yīng)，即刻與KadakX-Omat底片曝光洗片后用LeicaQ550-IW 圖像分析儀(德國(guó))進(jìn)行掃描，測(cè)定光密度，進(jìn)行半定量分析。

1.2.4 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子(GLUT-2)、葡萄糖激酶(GCK)表達(dá)水平的測(cè)定 按上述方法提取胰島中總蛋白質(zhì)，用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)GLUT-2、GCK。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前后的資料比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生理生化指標(biāo)

依折麥布組和db/db對(duì)照組的基線FBG、FSI、TG、LDL-C均無(wú)明顯差異。在8周齡，db/db小鼠的空腹血糖均已超過(guò)15 mmol·L-1。依折麥布組在治療6周后開始出現(xiàn)高血糖進(jìn)展速度的減緩，6周末時(shí)血糖顯著低于db/db對(duì)照組(P<0.05)。6周末時(shí)，依折麥布組TG、LDL-C明顯低于db/db對(duì)照組(P<0.05)。ISI在基線時(shí)依折麥布組和db/db對(duì)照組無(wú)明顯差異，投藥6周后顯著高于db/db對(duì)照組(P<0.05)(表1)。

組 別n體重/gFBG/mmol·L-1FSI/μg·L-1TC/mmol·L-1LDL-C/mmol·L-1ISIdb/m對(duì)照組基線2029.10±0.33a5.51±0.53a2.43±0.23a2.65±0.41a1.65±0.22a-2.58±0.15終點(diǎn)2035.80±0.54a5.71±0.63a2.63±0.31a2.55±0.53a1.79±0.27a-2.69±0.19db/db對(duì)照組基線2041.20±3.1817.30±3.998.51±1.265.14±0.803.88±0.44-4.95±0.32終點(diǎn)2050.20±4.3225.9±2.009.55±1.205.86±0.854.91±0.37-5.49±0.20依折麥布組基線2040.92±2.8418.37±4.259.01±1.375.30±0.773.69±0.74-5.07±0.34終點(diǎn)2045.40±3.81a18.82±3.99a7.58±0.67a4.21±0.63a2.78±0.62a-4.38±0.24

a 與db/db對(duì)照組比較，P<0.05

2.2 PTP1B表達(dá)水平的變化

db/db糖尿病小鼠PTP1B的表達(dá)水平是db/m對(duì)照組小鼠的2倍，依折麥布組治療后PTP1B表達(dá)水平下降至對(duì)照組的1.3倍(圖1)。

圖1依折麥布對(duì)db/db糖尿病小鼠胰島PTP1B表達(dá)的影響

Fig1ImpactofezetimibeonPTP1Bexpressionofdb/dbcontrolmice

2.3 GCK和GLUT-2表達(dá)水平的變化

與db/m對(duì)照組相比，db/db糖尿病小鼠GLUT-2、GCK表達(dá)水平明顯下降，而依折麥布組GCK和GLUT-2表達(dá)水平分別是治療前的1.5倍和1.8倍(圖2)。

3 討 論

依折麥布是全球第一種選擇性膽固醇吸收抑制劑，作用于小腸細(xì)胞的刷狀緣，通過(guò)抑制NPC1Ll(Niemann-Pick C1 like 1 protein) 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，選擇性地抑制膳食和膽汁中的膽固醇跨小腸壁轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟中，使得肝臟膽固醇儲(chǔ)存減少，導(dǎo)致肝臟LDL受體合成增加，加速LDL代謝，使血漿LDL-C水平降低[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，依折麥布作用位點(diǎn)NPC1L1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不僅在小腸表達(dá)，在肝臟、胰腺、膽囊、睪丸、胃亦有表達(dá)[5]。目前對(duì)肝胰島素抵抗的研究關(guān)注較多，但依折麥布對(duì)胰島的作用及對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少。

db/db小鼠是一種先天肥胖性2型糖尿病小鼠模型，由瘦素受體基因發(fā)生突變所致。一般于出生后3～4周即可表現(xiàn)為肥胖、血糖升高、胰島素抵抗等特性，是研究2型糖尿病的理想模型。我們前期的研究在國(guó)內(nèi)首次采用db/db 2型糖尿病小鼠模型，通過(guò)依折麥布干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，依折麥布在降低血脂的同時(shí)，可以降低血糖，改善葡萄糖耐量及胰島第一時(shí)相分泌，提高胰島素敏感性，減少胰島內(nèi)B細(xì)胞的丟失，保護(hù)B細(xì)胞功能[6]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)依折麥布一方面可以直接或通過(guò)抑制PTP1B的表達(dá)間接促進(jìn)胰島素受體(IR)、胰島素受體底物-1(IRS-1)數(shù)量及磷酸化水平，來(lái)改善胰島自身的胰島素抵抗，從而降低血糖；另一方面，它可以上調(diào)B細(xì)胞GLU-2、GCK的表達(dá)，恢復(fù)葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌來(lái)降低血糖。

圖2依折麥布對(duì)db/db糖尿病小鼠胰島GCK和GLUT-2表達(dá)的影響

Fig2ImpactofezetimibeonGCKandGLUT-2expressionofdb/dbcontrolmice

研究表明B細(xì)胞自身也存在胰島素抵抗，胰島B細(xì)胞上同樣存在胰島素受體及胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的其他部分如胰島素受體底物等，B細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙可導(dǎo)致胰島素分泌缺陷，B細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性減低，致B細(xì)胞自身胰島素抵抗[7]。胰島IR、IRS-1數(shù)量減少或磷酸化障礙均都可影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致胰島自身胰島素抵抗。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到正負(fù)調(diào)節(jié)蛋白的協(xié)同作用，而在眾多負(fù)調(diào)節(jié)因子中PTP1B作用突出。PTP1B是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的一員，在人體多種組織細(xì)胞中普遍存在，主要位于胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，它通過(guò)使激活的胰島素受體及胰島素受體底物等去磷酸化失活而發(fā)揮生理功能[8]。研究發(fā)現(xiàn)PTP1B的表達(dá)水平在糖尿病或發(fā)生胰島素抵抗時(shí)明顯升高。本實(shí)驗(yàn)顯示依折麥布組治療后PTP1B表達(dá)水平較治療前下降至對(duì)照組的1.3倍，提示依折麥布通過(guò)抑制胰島素信號(hào)負(fù)性轉(zhuǎn)導(dǎo)因子PTP1B的表達(dá)，促進(jìn)IR及IRS-1的磷酸化水平，從而改善胰島自身的胰島素抵抗。

GCK和GLUT-2均是特異性分布在B細(xì)胞中，是調(diào)節(jié)B細(xì)胞分泌胰島素的重要信號(hào)因子。GLUT-2是B細(xì)胞葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)體，GCK是B細(xì)胞的葡萄糖感受器和代謝信息產(chǎn)生器。當(dāng)體內(nèi)血糖升高并超過(guò)正常范圍時(shí)，GLUT-2會(huì)將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至胰島B細(xì)胞中，而后由GCK將葡萄糖磷酸化為6-磷酸葡萄糖進(jìn)入糖酵解及氧化過(guò)程，結(jié)果使得ATP與ADP的比值增加，細(xì)胞內(nèi)K+通道關(guān)閉，膜去極化，電壓依賴性Ca2+通道開放，Ca2+內(nèi)流，胰島B細(xì)胞中存儲(chǔ)胰島素的囊泡與質(zhì)膜融合，胰島素釋放[9]。釋放出的胰島素通過(guò)血液循環(huán)至機(jī)體其他組織參與血糖調(diào)節(jié)作用。因此，GCK和GLUT-2表達(dá)減少會(huì)導(dǎo)致胰島B細(xì)胞分泌胰島素減少，從而導(dǎo)致糖尿病發(fā)生。本研究顯示，與db/m對(duì)照組相比，db/db糖尿病小鼠GCK和GLUT-2的表達(dá)水平明顯下降，依折麥布治療后GCK和GLUT-2的表達(dá)分別是治療前的1.5倍和1.8倍，表明依折麥布通過(guò)上調(diào)GLU-2、GCK的表達(dá)，恢復(fù)葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌，降低血糖。

目前公認(rèn)2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制包括胰島素抵抗及胰島素分泌下降。本實(shí)驗(yàn)表明，依折麥布可以從改善上述兩個(gè)發(fā)病機(jī)制來(lái)改善db/db小鼠的糖代謝，表現(xiàn)出其對(duì)糖尿病狀態(tài)下調(diào)脂作用以外的優(yōu)勢(shì)。糖尿病合并冠心病等大血管并發(fā)癥的發(fā)生率較高，此時(shí)往往需要強(qiáng)化調(diào)脂治療來(lái)達(dá)到降低心肌梗死、中風(fēng)等不良事件發(fā)生率的目的。本研究提示，依折麥布因其改善糖代謝改善作用，在糖尿病合并高脂血癥的患者中可能有更加廣闊的應(yīng)用前景。

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