李莉，魯英，楊曉燕，歐江華，齊新

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 乳腺外科，新疆 烏魯木齊 830011)

p16基因是近年新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，是人類腫瘤中最常見的抑癌基因，位于人類第9號染色體短臂21區(qū)(p21)，編碼相對分子質(zhì)量為16 000的蛋白質(zhì)，可抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4和6的活性，防止細(xì)胞增殖，使Rb蛋白的磷酸化程度降低，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，從而起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用。早期正常情況下，P16蛋白與cyclin D競爭與CDK4結(jié)合，當(dāng)p16基因發(fā)生突變或功能缺失時，一方面不能產(chǎn)生蛋白競爭結(jié)合CDK4阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，另一方面又促進(jìn)了cyclin D1與CDK4結(jié)合形成復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞過度增生，向腫瘤方向發(fā)展[4]。

p16基因啟動子區(qū)CpG島甲基化，會導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄終止，引起基因失活，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。研究[6]證實，p16基因啟動子區(qū)CpG島甲基化與腦部腫瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、頭頸部腫瘤、肺癌、白血病等多種腫瘤的發(fā)病相關(guān)。本研究檢測了p16基因各位點(diǎn)的甲基化率，希望通過對p16甲基化的了解，獲得日后針對乳腺癌患者的個性化治療或早期檢測措施。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

2011年5月至2012年7月入住新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的新疆常住各族女性已確診為原發(fā)性乳腺癌的患者54例，且術(shù)前均未進(jìn)行放、化療，以健康體檢中心無乳腺疾病史及腫瘤史的自愿接受配對的女性54例按年齡相差±2歲、同民族的原則1∶1配對進(jìn)行病例對照研究。

1.2 樣本處理

血液樣本各3 ml，于EDTA抗凝管中當(dāng)天取回并放置-80 ℃冰箱保存。

1.3 實驗步驟

1.3.1 研究選取p16基因片段 見圖1。

圖1P16基因甲基化區(qū)域圖本課題研究所選取片段：PM00139972

Fig1ThechartofP16genemethylationregion

1.3.2 DNA的提取 從抗凝血中提取DNA：根據(jù)BioTeke DP2202大量全血基因組DNA提取試劑盒說明提取。在波長260 nm和280 nm處測光密度值(OD值)，并計算DNA濃度和純度。

1.3.3 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化 按照EpiTect Plus DNA Bisulfite試劑盒(QIAGEN公司)說明進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，終體積為140 μl，即DNA模版，-20 ℃保存。

1.3.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測定 用全自動核酸分析儀，無需備膠，放入卡夾，插入芯片，在WP、WI槽中放入8 ml 洗滌緩沖液和2 ml礦物油，緩沖槽里放入18 ml分離緩沖液和4 ml礦物油，在96孔架中放入樣品，做好標(biāo)記，每管2 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和18μl的稀釋緩沖液，放入標(biāo)記，進(jìn)行全自動分析。

1.3.6 焦磷酸測序反應(yīng)前單鏈DNA制備 Beeds 3 μl，結(jié)合緩沖液40 μl，模版20 μl，水17 μl配置為80 μl的微珠預(yù)混液，同時配置40 μl預(yù)混液：測序引物4 μl，退火緩沖液 36 μl。探頭吸附微珠預(yù)混液后依次經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%乙醇、變性液和洗液，利用真空預(yù)處理器使標(biāo)有生物素的DNA單鏈與未標(biāo)記生物素的DNA單鏈解鏈：探頭豎起直至水抽干，對準(zhǔn)測序反應(yīng)板，關(guān)閉真空，停留3 s，吸附預(yù)混液，將測序反應(yīng)板置80 ℃ 2 min，取出放置室溫。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，所以應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行配對秩和檢驗分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 PCR產(chǎn)物的鑒定結(jié)果

見圖2。圖中A3是15～600 bp的標(biāo)記，A1、A2是某對樣本p16區(qū)域PM00139972基因甲基化PCR擴(kuò)增結(jié)果，這與QIAGEN公司提供的參考長度175 bp基本一致，PCR擴(kuò)增的是目標(biāo)片段而且沒有引物二聚體。

圖2p16基因片段PM00139972的PCR鑒定結(jié)果

Fig2ThePCRidentificationresultsofp16genePM00139972

2.2 p16基因啟動子區(qū)域焦磷酸測序圖

見圖3、4。片段PM00139972有4個甲基位點(diǎn)。

圖3病例組某樣本p16基因CpG島甲基化程度位點(diǎn)1為21%，2為28%，3為7%，4為0%

Fig3CpGislandmethylationofp16geneinapatientgroupsample

圖4對照組某樣本p16基因CpG島甲基化程度位點(diǎn)1為20%，2為25%，3為5%，4為6%；M.亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化內(nèi)質(zhì)控

Fig4CpGislandmethylationofp16geneinacontrolgroupsample

2.3 p16基因各位點(diǎn)甲基化與雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人類表皮生長因子受 2(HE 2)、年齡分組及臨床病理分級的關(guān)系

表1p16基因各位點(diǎn)甲基化與年齡及病理等指標(biāo)關(guān)系的分析

Tab1Analysisoftherelationshipbetweenp16genemethylationandpathologicalindicatorsandage

變 量nCpG-1χ2值P值CpG-2χ2值P值CpG-3χ2值P值CpG-4χ2值P值ER +-17370.8520.8320.0960.023a0.4410.3140.4160.147PR +-10440.6640.6540.330.0530.9840.9790.6340.351Her-2 +-28260.2410.2270.5540.5390.5340.3190.3380.041a分級 123337142.1800.3360.1950.9070.8650.6490.1940.908 年齡/歲 26～35 36～45 46～55 56～65 65～519196570.9430.75591.6550.13138.1940.3726.6020.06

aP<0.05

2.4 p16基因各位點(diǎn)在病例組與對照組的甲基化

p16基因各位點(diǎn)甲基化率在病例組和對照組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表2p16基因各位點(diǎn)在病例組與對照組的甲基化關(guān)系的比較

Tab2Methylationcomparisonbetweencasegroupandcontrolgroupsofeachgenelocusinp16gene

p16基因啟動子區(qū)CpG島位點(diǎn)病例組甲基化例數(shù)甲基化率/%對照組甲基化例數(shù)甲基化率/%χ2值P值p16 CpG-14888.95293.91.215>0.05p16 CpG-24685.25092.61.5>0.05p16 CpG-31222.21629.60.771>0.05p16 CpG-4611.11018.51.174>0.05

3 討 論

p16基因的異常表達(dá)可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖活性增加，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，而且是導(dǎo)致乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要原因[13]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因子，也是決定化療與否及方案選擇的重要指標(biāo)[14]。乳腺癌切除術(shù)后，臨床實驗參考點(diǎn)只有復(fù)發(fā)或者死亡，這一不良結(jié)果通常需要很長的時間隨訪[15]，若能通過對p16基因和ER、PR等的聯(lián)合檢測來預(yù)測患者預(yù)后，那么就可以提前采取治療方法進(jìn)行預(yù)防。本課題組將進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行檢測，同時對患者進(jìn)行隨訪，結(jié)合環(huán)境等因素，探討乳腺癌患者治療前后甲基化的變化及總生存時間等預(yù)后情況，為臨床治療和預(yù)后提供更多依據(jù)。

[12] SHEN S X，DAHUI Q.Pyrosequencing data analysis software:a useful tool for EGFR，KRAS，and BRAF mutation analysis[J].Diagn Pathol，2012，7:56．