付信娟 孫方利 孫文琴 王和香

(青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)消化內(nèi)科，山東 青島 266033)

三聯(lián)脆性組氨酸(FHIT)基因〔1〕是近年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因之一，已發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤組織中出現(xiàn)異常表達(dá)，但FHIT基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及意義并無一致意見。Bcl-2是細(xì)胞凋亡中重要的調(diào)控因子，通過抑制細(xì)胞凋亡而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。本試驗(yàn)擬探討FHIT、Bcl-2基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 89例結(jié)直腸癌標(biāo)本均來自青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)2002年1月至2008年12月外科手術(shù)后經(jīng)病理確診的存檔蠟塊。其中男52例，女37例，年齡43～85歲，平均年齡64.2歲。按改良Duke分期，A期16例，B期26例，C期24例，D期23例。按組織學(xué)分級(jí)，高分化組17例，中分化組52例，低分化組20例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例。所有病例術(shù)前均未做放療、化療和免疫治療。正常對(duì)照組織標(biāo)本20例來源于距癌腫5 cm以上正常結(jié)直腸黏膜組織，病理證實(shí)無腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，無明顯炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增生等異常病變。

1.2材料與方法 免疫組化染色采用SP法。兔抗人多克隆抗體FHIT(即用型)、Bcl-2兔抗人多克隆抗體、SP 免疫組化試劑盒及顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。標(biāo)本經(jīng) 10%的甲醛固定，石蠟包埋，4 μm切片，常規(guī) HE染色。所有標(biāo)本在同一條件下嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，DAB顯色。選用公司提供的已知FHIT陽性染色結(jié)直腸癌切片在同一條件下染色作為陽性對(duì)照，以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) FHIT、Bcl-2蛋白均定位于胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色表達(dá)。每例標(biāo)本隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，根據(jù)著色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞結(jié)果進(jìn)行定性分析：先按染色強(qiáng)度記分：0分、1分、2分、3分分別表示無色、淺黃色、棕黃色、棕褐色。再按陽性細(xì)胞所占百分比記分：0分為陽性細(xì)胞<5%，1分為陽性細(xì)胞5%～25%，2分為陽性細(xì)胞25%～50%，3分為陽性細(xì)胞50%～75%，4分為陽性細(xì)胞>75%。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞所占的百分比的乘積0～4為陰性，6～12為陽性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1FHIT、Bcl-2蛋白在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常結(jié)直腸黏膜組織中的表達(dá) 見圖1。FHIT蛋白在結(jié)直腸癌組織中的陽性率明顯低于正常結(jié)直腸黏膜組織(58.4% vs，95.0%，P=0.002)。Bcl-2蛋白在結(jié)直腸癌組織中的陽性率明顯高于正常結(jié)直腸黏膜組織(71.9% vs 40.0%，P=0.006)。

圖1 FHIT、Bcl-2基因在不同結(jié)直腸黏膜組織的表達(dá)(SP)

2.2結(jié)直腸癌組織中FHIT、Bcl-2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織中FHIT蛋白表達(dá)在A期、B期、C期、D期中的陽性率逐漸降低(P<0.05)。隨腫瘤細(xì)胞分化程度的降低，F(xiàn)HIT蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，F(xiàn)HIT蛋白陽性率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。FHIT蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)與患者性別、年齡無關(guān)。結(jié)直腸癌組織中隨腫瘤細(xì)胞分化程度的降低，Bcl-2表達(dá)升高(P<0.05)。Bcl-2蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。Bcl-2蛋白表達(dá)情況與腫瘤Duke分期、患者性別、年齡無關(guān)。見表1。

表1 結(jié)直腸癌組織中FHIT、Bcl-2陽性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.3結(jié)直腸癌組織中FHIT、Bcl-2 表達(dá)的相關(guān)性 結(jié)直腸癌組織中FHIT與Bcl-2的表達(dá)有一定相關(guān)性(r=0.257,P=0.010)。

3 討 論

FHIT基因是 Ohta等〔1〕在1996年用定位克隆技術(shù)和外顯子捕獲法在3p14.2上確定的一個(gè)新基因，也是第1個(gè)將脆性位點(diǎn)和腫瘤聯(lián)系起來的抑癌基因。FHIT基因定位于染色體3p14.2，全長(zhǎng)約500 kb，由10個(gè)外顯子組成，其cDNA全長(zhǎng)1 095 bp，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物約為1.1kb的mRNA，編碼產(chǎn)物是由147個(gè)氨基酸組成的分子量為16.8 kD的蛋白質(zhì)，定位于細(xì)胞質(zhì)。研究證實(shí)〔2〕FHIT體外編碼二腺苷三磷酸(Ap3A)水解酶，在全身正常組織器官均有低水平表達(dá)，且FHIT基因在多種腫瘤組織中均出現(xiàn)表達(dá)降低甚至缺失，但對(duì)于FHIT基因影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚不明確。

本研究結(jié)果提示FHIT基因與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)。王佩飛等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)：FHIT在正常結(jié)腸黏膜、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及結(jié)腸癌腫的表達(dá)逐漸降低，均表明FHIT表達(dá)降低與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。FHIT蛋白的表達(dá)與腫瘤組織分化程度、Duke分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與性別、年齡無關(guān)，而這也說明FHIT蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌的進(jìn)一步發(fā)展及腫瘤浸潤(rùn)有關(guān)。Sarli 等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HIT蛋白表達(dá)降低與錯(cuò)配修復(fù)基因缺乏有關(guān)，提示FHIT基因可能通過涉及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)的基因通路影響結(jié)直腸癌的發(fā)生。楊平等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HIT基因可能參與結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，其表達(dá)下降可能與結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)。

Bcl-2基因位于18q21，由3個(gè)外顯子組成，編碼239個(gè)氨基酸組成的分子量為26 kD的Bcl-2A蛋白和205個(gè)氨基酸組成的分子量為22 kD的Bcl-2B蛋白。Bcl-2 是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要基因，主要通過調(diào)節(jié)線粒體的功能來抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞生存，其過表達(dá)參與腫瘤的發(fā)生，是腫瘤靶向治療的潛在基因。楊闖等〔6〕報(bào)道，Bcl-2基因的表達(dá)與肝細(xì)胞癌的發(fā)病年齡、性別、重量大小、UICC分期和轉(zhuǎn)移均無關(guān)，而關(guān)于Bcl-2 的表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外報(bào)道不一。本實(shí)驗(yàn)提示其可作為判斷結(jié)直腸癌惡性程度的指標(biāo)之一，與鄧文英等〔7〕報(bào)道一致。Barrasa等〔8〕報(bào)道，對(duì)丁酸鹽抵抗的結(jié)腸腺癌細(xì)胞系(BCS-TC2.BR2)，通過增加Bcl-2的表達(dá)，降低了其對(duì)膽汁酸誘導(dǎo)的凋亡的敏感性。

本研究結(jié)果顯示FHIT蛋白表達(dá)降低及Bcl-2蛋白表達(dá)升高可以作為判斷結(jié)直腸癌惡性程度及預(yù)測(cè)其發(fā)展、轉(zhuǎn)移的指標(biāo)，也為腫瘤的綜合治療提供重要的試驗(yàn)支持。目前針對(duì)FHIT的基因治療已取得可喜進(jìn)展，而針對(duì)Bcl-2的小分子抑制劑也為腫瘤的靶向治療提供了新的研究方向。

4 參考文獻(xiàn)

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3王佩飛，陳建武，鄭佩贊，等.Survivin、fhit在結(jié)直腸良惡性病變中的表達(dá)及意義〔J〕.醫(yī)學(xué)研究雜志，2008；37(1)：37-40.

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6楊 闖，魏振彤，鄭 宇，等.肝癌中Bcl-2、Bax和C-myc基因的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009；29(4)：450-1.

7鄧文英，羅素霞，陳小兵，等.Bcl-2、Caspase-3在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009；17(12)：2363-5.

8Barrasa JI，Santiago-Gomez A，Olmo N，etal.Resistance to butyrate impairs bile acid-induced apoptosis in human colon adenocarcinoma cells via up-regulation of Bcl-2 and inactivation of Bax〔J〕.Biochem Biophys Acta，2012；1823(12)：2201-9.