石雁冰 郉立志 李樹法 張媛媛 張?zhí)m舉 馬桂潔 姜春艷

(貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院門診部，貴州 貴陽 550002)

目前1型糖尿病(T1DM)以胰島素終身替代療法和非特異性免疫抑制為主要治療手段，其費(fèi)用高昂且副作用大，亟需尋找一種特異性免疫干預(yù)策略〔1～4〕。研究表明，誘導(dǎo)自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的免疫耐受是一種有效的T1DM治療策略，可減緩甚至完全阻斷T1DM的發(fā)生和發(fā)展〔5,6〕。B、T淋巴細(xì)胞弱化因子(BTLA)為近年發(fā)現(xiàn)的負(fù)性共刺激分子，抑制或下調(diào)T細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，參與多種免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展〔7,8〕。ZnT8又稱SLC30A8，介導(dǎo)鋅離子從胞漿至囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)，參與胰島素的合成、儲(chǔ)存和分泌的調(diào)節(jié)。ZnT8也可作為自身抗原引起T細(xì)胞介導(dǎo)的以β細(xì)胞受損為特征的自身免疫反應(yīng)，甚至誘發(fā)T1DM〔9〕。在本實(shí)驗(yàn)中，制備基于ZnT8表位肽和BTLA的疫苗，并觀察對(duì)CD8+T 細(xì)胞的抑制效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1融合肽 為RKKRRQRRRLLIDLTSFL，委托中科亞光合成。其中N末段RKKRRQRRR為含有正電荷的陽離子穿膜肽HIV-Tat49-57 , C末段LLIDLTSFL為ZnT8的人白細(xì)胞抗原(HLA2)-A2.1限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表位。BTLA表達(dá)質(zhì)粒和對(duì)照空白質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。CD8+T細(xì)胞分離試劑盒購自Miltenyi 公司。ELISPOT檢測(cè)干擾素(IFN-γ)試劑盒購于法國DIACLONE公司。其他為常用試劑。

1.2疫苗的制備 在特定的NaCl濃度下將100 μg/ml的100 μl陽離子肽溶液逐滴滴入100 μl混旋狀態(tài)含有500 μg/ml DNA的水溶液中，5 μl/min，從而制備疫苗。滴定完畢后制備產(chǎn)物繼續(xù)混旋30 min，靜置30 min。

1.3體外免疫 HLA2-A2.1 陽性的健康人外周血濃縮白細(xì)胞經(jīng)常規(guī)聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心法分離，獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞為1×106/ml。分別用肽終濃度為10 μmol/L 的含有表達(dá)質(zhì)粒BTLA的疫苗+10 μmol/ L 的LLIDLTSFL多肽， 空白質(zhì)粒疫苗+10 μmol/ L 的LLIDLTSFL多肽，磷酸鹽緩沖液(PBS)+10 μmol/ L 的LLIDLTSFL多肽，反復(fù)刺激PBMC，每7 d 刺激1 次，刺激3次后第3天，收集PBMC，作為效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)51 Cr釋放實(shí)驗(yàn)。

1.4免疫磁珠分選( MACS) 純化CD8+T細(xì)胞 取4×107細(xì)胞，1 200 r/min 離心10 min，去上清液后用160 μl 緩沖液重懸，加40 μl 抗體Cocktail 充分混勻，4℃孵育10 min。加160 μl緩沖液，1 200 r /min離心10 min，去上清液，再加入320 μl 緩沖液、80 μl磁性微珠，充分混勻，4℃孵育15 min。用適量緩沖液沖洗，1 200 r/min離心10 min。吸除上清液，用500 μl 緩沖液重懸細(xì)胞， 200目篩網(wǎng)過濾成無氣泡的單細(xì)胞懸液。將MS細(xì)胞分離柱置于MACS 磁力架上，先用500 μl 緩沖液洗柱，再將細(xì)胞懸液通過MS 柱，1 500 μl 緩沖液洗滌，收集流出液體，離心收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)。

1.5ELISPOT檢測(cè) 參照ELISPOT(IFN-γ)試劑盒使用說明書進(jìn)行檢測(cè)。調(diào)整細(xì)胞為1×106個(gè)/ml，于96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，孵育時(shí)間為48 h。陰性對(duì)照不加細(xì)胞孵育，計(jì)數(shù)各孔出現(xiàn)的色斑數(shù)目。

1.6淋巴細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 調(diào)整細(xì)胞為1×106個(gè)/ml，于96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，加入終濃度為100 μg/ml的LLIDLTSFL(ZnT8107-115)，培養(yǎng)72 h。每孔再加入0.1 ml濃度為1×103μCi/L的3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR) 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用PBS漂洗細(xì)胞3次，甲醛固定10 min，再用4℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為5% 的三氯醋酸溶液漂洗3次，每孔加入0.5 ml濃度為0.3 mol/L的NaOH溶液，60℃水浴反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移入閃爍瓶中，加入5 ml 閃爍液，用液體閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)每分鐘的閃爍次數(shù)(cpm)，測(cè)定DPM值(反映細(xì)胞DNA 合成速率)，重復(fù)測(cè)定3 次。

1.7靶細(xì)胞的制備與標(biāo)記 10 mg/L的LLIDLTSFL(ZnT8107-115)與1×106個(gè)/ml的T2細(xì)胞在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)6 h后作為靶細(xì)胞。采用標(biāo)準(zhǔn)的51Cr釋放實(shí)驗(yàn),于V型板各孔中加入標(biāo)記的靶細(xì)胞1×104/孔。各靶細(xì)胞孔中加入不同稀釋度的效應(yīng)細(xì)胞, 使相應(yīng)的效靶比分別為25∶1、50∶1和100∶1，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。最大殺傷采用2 mol/L的HCl，自釋放為靶細(xì)胞加培養(yǎng)基。于37℃、50 ml/L CO2孵育4 h，以1 000 r/min 離心10 min，各取上清液100 μl，用γ計(jì)數(shù)器分別測(cè)定液體閃爍計(jì)數(shù)值(cpm值)，計(jì)算51Cr特異釋放率。51Cr特異釋放率=(實(shí)驗(yàn)組cpm平均值-自釋放cpm平均值)/(最大釋放cpm平均值-自釋放cpm平均值)×100%

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0軟件和t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)差異進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1ELISPOT檢測(cè)結(jié)果 用ELISPOT檢測(cè)CD8+T細(xì)胞的IFN-γ分泌情況。BTLA組CD8+T細(xì)胞的IFN-γ分泌數(shù)量為(46±7)個(gè)，而空白質(zhì)粒組和PBS對(duì)照組的IFN-γ分泌數(shù)量為(97±16)個(gè)和(104±19)個(gè)。實(shí)驗(yàn)證明含有BTLA的疫苗能有效抑制CD8+T細(xì)胞的活化。

2.2淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果 用3H-TdR檢測(cè)CD8+T細(xì)胞的增殖情況。BTLA組CD8+T細(xì)胞的cpm值為(37 000±3 100)，而空白質(zhì)粒組和PBS對(duì)照組的cpm值為(51 000±6 100)和(53 000±6 400)。實(shí)驗(yàn)證明含有BTLA的疫苗能有效抑制CD8+T細(xì)胞的增殖。

2.3Cr釋放分析 進(jìn)一步采用51 Cr釋放分析各組誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷情況。BTLA組誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的殺傷率均明顯低于空白質(zhì)粒組和PBS對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)證明含有BTLA的疫苗能有效抑制CD8+T細(xì)胞的對(duì)靶細(xì)胞的殺傷。見圖1。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率

3 討 論

目前普遍認(rèn)為T1DM是在遺傳和環(huán)境因素共同作用下，由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的器官特異性自身免疫性疾病〔10,11〕。主要是由于免疫系統(tǒng)的異常，CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞對(duì)胰島的浸潤，引發(fā)胰島炎癥并導(dǎo)致對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷，使胰島素分泌絕對(duì)減少，引起體內(nèi)胰島素絕對(duì)缺乏從而導(dǎo)致血糖持續(xù)升高，產(chǎn)生T1DM〔12,13〕。多種免疫機(jī)制參與T1DM的發(fā)病，為糖尿病的預(yù)防提供了途徑和方向。目前研究表明，應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)藥物和細(xì)胞等手段可以抑制胰島炎癥作用，減少β細(xì)胞的免疫破壞及凋亡，誘導(dǎo)特異性免疫耐受，從而達(dá)到預(yù)防及阻止糖尿病發(fā)病。

BTLA是2003年發(fā)現(xiàn)的CD28家族共抑制受體, 主要表達(dá)于T、B細(xì)胞, 在DC、單核及自然殺傷(NK)細(xì)胞上也有表達(dá), 其結(jié)構(gòu)和功能與CD28家族其他兩種抑制性受體CTLA-4和PD-1相似〔14〕。現(xiàn)已證明BTLA的配體是HVEM, 兩者結(jié)合可負(fù)性調(diào)節(jié)T、B細(xì)胞的激活與增殖, 維持樹突細(xì)胞在內(nèi)環(huán)境中的穩(wěn)定, 抑制記憶性CD8+T細(xì)胞的分化, 調(diào)節(jié)機(jī)體固有免疫系統(tǒng)早期抗感染的過程等作用〔15〕。ZnT8 是專一性的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體家族-ZnT 家族的成員之一。ZnT8 是自身免疫性T1DM的主要自身抗原之一，其敏感性及特異性與IA2A、GADA、IAA 這三個(gè)被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”的抗原相似〔16〕。ZnT8 在胰島功能調(diào)節(jié)中的作用使其有望成為糖尿病治療的新靶點(diǎn)。

因此，理論上基于ZnT8表位肽和BTLA的疫苗有可能抑制抗原特異性的CD8+T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答。在本實(shí)驗(yàn)中，制備了基于ZnT8表位肽和BTLA的疫苗，并觀察其對(duì)CD8+T細(xì)胞的免疫抑制效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)在體外免疫人外周血單個(gè)核細(xì)胞，檢測(cè)對(duì)CD8+T細(xì)胞增殖和活化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示該疫苗能有效抑制人外周血單個(gè)核細(xì)胞的CD8+T細(xì)胞增殖，細(xì)胞因子分泌和對(duì)靶細(xì)胞的殺傷能力。

綜上所述，基于ZnT8表位肽和BTLA的疫苗對(duì)CD8+T細(xì)胞具有免疫抑制效應(yīng)，為T1DM的治療提供了理論基礎(chǔ)。

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