鄭 斌 劉 濤 鄭永晨 李佳睿

(吉林大學第二醫(yī)院眼科，吉林 長春 130041)

Toll樣受體9(TLR9)，是重要的模式識別受體，識別一組具有特定結(jié)構(gòu)的寡核苷酸序列CpG，廣泛地存在于病原體中。TLR9在識別病原體和激活天然免疫方面起著非常重要的作用〔1，2〕，激活的TLR9不但能夠誘導天然免疫應答，并且對特異性免疫反應的發(fā)生有幫助。TLR9能夠介導CpG對多種免疫細胞的激活，使細胞表面CD40、CD80、CD86等共刺激分子以及MHCⅡ類分子表達增加，而且促使細胞因子TNF-β、IFN-γ、IL2等的分泌，從而誘導Th1型免疫應答。TLR9參與CpG誘導的細胞活化及抑制其凋亡〔3～5〕。TLR9通過增加活化的DC細胞的生命，促進維穩(wěn)Th1型應答。通過CpG與TLR9的作用，DC細胞等抗原提呈細胞能夠交叉提呈外源性抗原，從而交叉激活CD8+細胞。TLR9是連接獲得性免疫和天然免疫的橋梁〔6，7〕。

1 材料和方法

1.1材料 DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清(Hyclone)，大腸桿菌JM109，肝癌細胞系SMMC7721(本室保存)；真核表達載體pcDNA3.0，Trizol試劑，G418(Invitrogen公司)λ-HindⅢ digest DNA Marker，T4 DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶(BamH I和EcoR I)，DNA片段回收/純化試劑盒，Oligo(dT)18，dNTP；TA克隆試劑盒(大連寶生物);Taq DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶(Roch);小量質(zhì)粒提取試劑盒，瓊脂糖，引物合成，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，蛋白胨和酵母粉(OXOID)，DNA序列分析(上海生工生物公司)。MTT；兔抗人TLR9抗體和熒光素標記羊抗兔抗體(Bioss);引物序列：上游5′-AGCTGGATCCATGGGTTTCTGCCGCAGCGCCC-3′，帶有BamH I酶切位點；下游 5′-AGCTGAATTCCTATTCGGCCGTGGGTCCC-3′帶有EcoR I酶切位點。硫化寡核苷酸(ODN)2006S(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)，1826S(TCCATGACGTTCCTGACGTT)，2216S(GGGGGACGATCGTCGGGGG)，M362S(TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT)。低溫臺式離心機(德國Heraeus Stratos)；PCR儀(東勝公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(150i.Thermal);全波長分光光度儀( Thermal);倒置顯微鏡和倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯)。核酸電泳設(shè)備和數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)(Tanon公司)。

1.2方法

1.2.1外周血單個核細胞RNA提取和人TLR9基因克隆 用淋巴細胞分離液分離外周血單核細胞，用Trizol試劑提取外周血RNA；總RNA以O(shè)ligo(dT)18為引物，Roch長片段逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA；用Roch長片段TaqDNA聚合酶和人TLR9上下游引物進行PCR擴增TLR9基因；擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。從瓊脂糖電泳凝膠中回收DNA片段，回收片段與TA克隆載體連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上篩選陽性克??；擴大培養(yǎng)陽性克隆菌，提取重組質(zhì)粒(TA-TLR9)酶切和DNA序列分析鑒定。

1.2.2人TLR9基因亞克隆入pcDNA3.0真核表達載體 用內(nèi)切酶BamH I和EcoR I分別雙酶切pcDNA3.0和TA-TLR9質(zhì)粒，凝膠電泳回收和純化(TA-TLR9收集3 100 bp片段)；用T4 DNA連接酶連接；轉(zhuǎn)化JM109，在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基篩選陽性克隆，提取陽性克隆質(zhì)粒DNA(pcDNA-TLR9)，用內(nèi)切酶和電泳鑒定。

1.2.3人TLR9重組質(zhì)粒pcDNA-TLR9轉(zhuǎn)染真核細胞 常規(guī)培養(yǎng)和傳代SMMC7721細胞，細胞生長狀態(tài)良好、融合度在75%時轉(zhuǎn)染。采用磷酸鈣方法轉(zhuǎn)染細胞：pcDNA-TLR9 DNA 10 μg(218 μl)中加入32 μl氯化鈣(2.0 mol)，混勻，緩慢加入250 μl 2倍的HBS緩沖液(HEPES 50 mmol;NaCl 280 mmol; Na2HPO450 mmol;NaH2PO450 mmol)混勻，靜止30 min，形成白色沉淀顆粒。棄細胞培養(yǎng)液，將磷酸鈣DNA液加入到培養(yǎng)細胞表面，37℃，5%CO2培養(yǎng)1 h，棄凈液體，加入IMDM培養(yǎng)液(10%血清)，37℃，5%CO2培養(yǎng)，次日換液，48 h后換成含G418的培養(yǎng)液(500 μg/ml)，每3～5 d換液1次，直至大量細胞死亡后新克隆重新生長，再在G418選擇壓力下傳代5次，建立穩(wěn)定的SMMC7721-pcDNA-TLR9細胞系(SMMC7721-TLR9)。同時用空載體pcDNA3.0轉(zhuǎn)染細胞作為對照(SMMC7721-pcDNA3.0)。

1.2.4SMMC7721-TLR9細胞系的鑒定 分別提取SMMC7721，SMMC7721-TLR9和SMMC7721-pcDNA3.0細胞系DNA，在瓊脂糖凝膠上電泳，分別回收DNA條帶，凝膠純化試劑回收DNA，用PCR方法擴增人TLR9基因片段鑒定細胞DNA中人TLR9的重組。用兔抗人TLR9抗體和熒光標記羊抗兔抗體進行免疫染色鑒定人TLR9的表達，三組細胞同時進行檢測，熒光顯微鏡下拍照。

1.2.5SMMC7721-TLR9細胞系對CpG的反應 分別培養(yǎng)SMMC7721，SMMC7721-TLR9和SMMC7721-pcDNA3.0細胞，按1.0×104細胞/ml分裝于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，37℃，5%CO2培養(yǎng)，細胞融合度達75%時加CpG：棄凈培養(yǎng)液，用IMDM培養(yǎng)液稀釋CpG，每個細胞系分別加入CpG 2006S，1826S，2216S和M362S終濃度為5.0 μg/ml，每孔100 μl，37℃，5%CO2培養(yǎng)48 h，棄凈培養(yǎng)液，用無血清IMDM稀釋MTT(0.5 mg/ml)，每孔加100 μl，37℃，5%CO2培養(yǎng)4 h，棄凈培養(yǎng)液，用無血清IMDM洗2次，每孔加入二甲基亞砜100 μl，避光室溫輕搖1 h溶解甲瓚，檢測570 nm光密度，同時設(shè)置正常對照和空白對照，檢測值減空白對照，并以試驗孔的值比對照值的百分率表示細胞增殖率。

2 結(jié) 果

2.1TLR9基因片段的擴增 經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定擴增出大小約為3 100 bp的DNA片段(圖1)。

2.2人TLR9-TA重組質(zhì)粒鑒定 人TLR9-TA重組質(zhì)粒全長3 099 bp，與GenBank序列對比(BLAST)，結(jié)果顯示為人TLR9基因的全長開放讀碼框架。

2.3人TLR9基因亞克隆入pcDNA3.0真核表達載體 TLR9-TA載體亞克隆TLR9基因進入pcDNA3.0的BamHⅠ和EcoRⅠ位點之間，得到人TLR9基因pcDNA3.0重組質(zhì)粒(pcDNA-TLR9)。

2.4pcDNA-TLR9轉(zhuǎn)染SMMC7721細胞和鑒定 磷酸鈣法將pcDNA-TLR9和pcDNA3.0分別轉(zhuǎn)入SMMC7721細胞，經(jīng)G418選擇培養(yǎng)下得到陽性克隆，分別用PCR(圖3，圖4)和免疫熒光(圖5)鑒定，僅有pcDNA-TLR9轉(zhuǎn)染SMMC7721細胞DNA可以擴增出TLR9基因，轉(zhuǎn)染pcDNA-TLR9的SMMC7721細胞質(zhì)周邊可見綠色熒光，其他兩組細胞未見熒光。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

1：ΛDNA HindⅢ酶切標尺；2：pcDNA-TLR9 DNA酶切

1，2，3分別是SMMC7721-TLR9，SMMC7721-pcDNA3.0和 SMMC7721組DNA；4和5分別是DL-2000和ΛDNA HindⅢ酶切標尺

2.5SMMC7721-TLR9細胞系對CpG的反應 SMMC7721-TLR9，SMMC7721-pcDNA3.0和 SMMC7721細胞系分別用不同的CpG刺激，培養(yǎng)48 h，結(jié)果顯示2006S對SMMC7721-TLR9細胞有刺激增殖作用。見圖6。

1，2，3分別是SMMC7721-TLR9，SMMC7721-pcDNA3.0和 SMMC7721DNA PCR產(chǎn)物；4：DL-2000標尺

圖5 pcDNA-TLR9的SMMC7721細胞免疫熒光檢測結(jié)果

1：對照細胞；2：2006S；3：2216S；4：M362S；5：1826S

3 討 論

在研究免疫佐劑和其作用機制時發(fā)現(xiàn)細菌DNA對哺乳動物免疫細胞具有激活作用，免疫激活通過TLR9介導，因此證明了細菌或病毒DNA是產(chǎn)生免疫活性的分子基礎(chǔ)，也揭開了TLR9信號通路研究的序幕。經(jīng)過10余年的研究，TLR9的組織表達、下游信號分子以及信號調(diào)控逐漸明晰〔1〕。TLR9主要分布在免疫細胞，目前認為TLRs與配體結(jié)合后有四種不同的銜接分子：MyD88、TIRAP/MAL、TRIF、TRAM〔2，3〕，含有非甲基化的胞嘧啶和鳥嘌呤(CpG)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸是TLR9的天然配體，具有一定結(jié)構(gòu)的CpG分子即有免疫刺激作用。目前發(fā)現(xiàn)了大量的CpG分子具有不同功能活性的作用，包括用于刺激免疫細胞產(chǎn)生干擾素等細胞因子的CpG，新型CpG不斷發(fā)現(xiàn)〔8～10〕，體現(xiàn)出具有廣泛的應用前景。但是驗證CpG活性的方法是利用動物或人外周血單個核細胞，在CpG的作用下表現(xiàn)增殖或抑制，每次試驗的均質(zhì)性和方便性受到影響，且不能大規(guī)模自動化篩選新型CpG。

本研究從人外周血單個核細胞中克隆出人TLR9全長cDNA，酶切和DNA序列分析證明為人TLR9基因完整的開放讀碼框架。將人TLR9基因重組入真核表達載體pcDNA3.0，制備出pcDNA3.0-TLR9重組質(zhì)粒，將pcDNA3.0-TLR9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入人肝癌細胞系SMMC7721，經(jīng)G418選擇篩選，得到攜有pcDNA3.0-TLR9基因的SMMC7721細胞系SMMC7721-TLR9。

SMMC7721-TLR9細胞系表達TLR9蛋白，并在CpG的刺激下表現(xiàn)增殖反應。結(jié)果表明制備的SMMC7721-TLR9細胞系可以用于CpG研究，但是本文的結(jié)果顯示SMMC7721-TLR9細胞系僅對2006S CpG增殖反應較強，對其他3種反應弱，可能的原因是MTT方法不是十分敏感，或者是實驗條件沒有達到最佳狀態(tài)，需要進一步研究。

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