李軍勤, 殷小雯, 宋培勇*

1.遵義師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 貴州 遵義 563002;

2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 長春 130117

在我國分布有4種和1變種紅豆杉，分別為中國紅豆杉(Taxuschinensis)、東北紅豆杉(Taxuscuspidata)、西藏紅豆杉(Taxuswallichiana)、云南紅豆杉(Taxusyunnanensis)和南方紅豆杉(Taxuschinensisvar.mairei)。南方紅豆杉是中國紅豆杉的變種，又稱美麗紅豆杉，產(chǎn)于中國長江流域以南，常生于海拔1 000～1 200 m以下山林中，呈星散分布(如在貴州很多地區(qū)就有南方紅豆杉的分布)，為我國特有，是公認(rèn)瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌植物。有最佳抗癌藥物之稱的紫杉醇(paclitaxel，商品名 Taxol)最先就是從短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)中提取的[1]。1993年，Stierle等[2]第一次從太平洋紫杉植物體內(nèi)分離出一種可產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌安德魯紫衫菌(Taxomycesandreanae)，從此在國際上掀起了產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌分離的熱潮。植物表面消毒是分離植物內(nèi)生菌的首要步驟，是利用物理或化學(xué)方法對植物體的表面進行清洗浸泡以殺死表面附生的細菌、病原真菌等部分微生物而不傷害植物體內(nèi)所生存的微生物的過程，消毒的難點在于既要表面消毒徹底，又要保證植物體內(nèi)的內(nèi)生菌不受到傷害。因此要根據(jù)植物材料的不同，在消毒劑的種類、濃度和浸泡時間上做精心的選擇和設(shè)計。目前使用的植物表面消毒技術(shù)大多使用升汞(HgCl2)[3～5]，而升汞有毒，并且還有一定的致癌性，因此開發(fā)更安全有效的植物表面消毒技術(shù)非常必要。鑒于有關(guān)植物內(nèi)生菌分離時的表面消毒方法的系統(tǒng)報道[6，7]較少，本研究探索用2％ 次氯酸鈉(NaClO)配合75％ 乙醇對南方紅豆杉內(nèi)生真菌分離時的植物材料進行表面消毒，主要在時間程序上進行摸索，以期為南方紅豆杉內(nèi)生真菌的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)方法。

1 材料與方法

1.1試驗材料

試驗所用材料南方紅豆杉枝條和樹皮，采集于貴州省鳳岡縣土溪鎮(zhèn)官壩村謝家橋(2014年1月)、湄潭縣西河鄉(xiāng)龍孔村后頭灣(2014年2月)和茅坪鎮(zhèn)附近(2014年3月)，備用。

1.2培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：按照《微生物學(xué)實驗指導(dǎo)》[8]方法進行配制。

1.3材料預(yù)處理

將采集到的新鮮紅豆杉枝、葉、皮(先去除老皮)用流水沖洗，晾干，修剪成1～2 cm長的小段或1 cm見方的小塊。

1.4表面消毒試驗

參考Guo等[9]和宋培勇等[10]的植物表面消毒方法，對南方紅豆杉不同部位的外植體按以下程序進行表面消毒：將外植體(葉、莖和皮)在無菌水中漂洗3次，用75％乙醇浸泡3 min后，轉(zhuǎn)入2％ NaClO進行浸泡處理，然后用75％乙醇對葉、莖和皮做浸泡處理，最后用無菌水漂洗3次。

1.5表面消毒條件研究

表面消毒步驟中,NaClO、乙醇浸泡處理時間對消毒效果有較大影響，分別設(shè)置不同消毒時間組合，考察消毒流程中時間設(shè)置對表面消毒效果的影響。NaClO浸泡時間設(shè)1 min、2 min和3 min共三個處理；75％乙醇浸泡根據(jù)不同外植體采用不同浸泡時間處理，見表1。

1.6內(nèi)生菌培養(yǎng)

取按1.4方法表面消毒后的材料接PDA平板，每種處理的材料接3個平板，每個平板接同種處理材料3個，壓緊壓實后倒置于25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d。取每種處理的最后一次漂洗液0.1 mL涂2個平板作為對照組，以檢驗表面消毒效果。

表1 75％乙醇對不同外植體的浸泡消毒處理

2 結(jié)果與分析

2.1不同消毒程序?qū)δ戏郊t豆杉葉的表面消毒效果

對南方紅豆杉葉進行表面消毒，采用不同2％ NaClO和75％乙醇浸泡時間，表面消毒處理后的南方紅豆杉葉在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d后觀察，試驗組和對照組平板上真菌生長情況見表2。

從表2可以看出，南方紅豆杉葉采取“2％ NaClO處理1 min，75％乙醇處理0.5～3 min”，“2％ NaClO處理2 min，75％乙醇處理0.5～2 min”，消毒結(jié)束后仍有雜菌殘留；“2％ NaClO處理3 min，75％乙醇處理3 min”，分離不到內(nèi)生菌。因此，處理Ⅰ～Ⅶ和處理Ⅻ表面消毒全不合格。其他幾種處理，達到的表面消毒效果彼此之間有差異，以處理Ⅷ“2％ NaClO處理2 min，75％乙醇處理3 min”，表面消毒效果最好。

2.2不同消毒程序?qū)δ戏郊t豆杉莖的表面消毒效果

對南方紅豆杉莖的表面消毒結(jié)果與葉相類似，見表3。以處理Ⅷ的效果最好，即，以“2％ NaClO處理2 min，75％乙醇處理5 min”處理紅豆杉莖效果最佳。

2.3不同消毒程序?qū)δ戏郊t豆杉皮的表面消毒效果

對南方紅豆杉皮的表面消毒結(jié)果見表4。以處理Ⅷ的效果為最好，即，以“2％ NaClO處理2 min，75％乙醇處理7 min”處理紅豆杉皮效果最佳。

表2 不同消毒程序?qū)δ戏郊t豆杉葉的表面消毒效果

表3 不同消毒程序?qū)δ戏郊t豆杉莖的表面消毒效果

表4 不同消毒程序?qū)δ戏郊t豆杉皮的表面消毒效果

3 討論

從葉、莖、皮表面消毒效果看，2％ NaClO的消毒時間1 min太短(消毒不徹底)，3 min太長(內(nèi)生真菌損失嚴(yán)重)，而2 min比較合適，且2％ NaClO的消毒最佳時間與取材關(guān)系不大。從75％乙醇的消毒時間看，葉、莖和皮的最佳消毒時間分別是3 min、5 min和7 min，這說明材料不同，時間各異。試驗組平板生長的內(nèi)生真菌菌落數(shù)較多，同時對照組平板沒有菌落生長被認(rèn)為是內(nèi)生菌分離的最好效果，以此為評判標(biāo)準(zhǔn)，分離南方紅豆杉內(nèi)生真菌的最佳表面消毒方法為：無菌水漂洗3次→75％乙醇浸泡3 min→2％ NaClO浸泡2 min→75％乙醇浸泡3～7 min(即葉3 min、莖5 min、皮7 min)→無菌水漂洗3次。

表面消毒是植物內(nèi)生菌分離時一個非常重要的環(huán)節(jié)，旨在殺死植物表面附生菌的同時, 盡量保護植物內(nèi)生菌不受傷害。不同的消毒劑類型、濃度和消毒時間等均直接影響表面消毒效果[11]。選用2％ NaClO和75％的乙醇進行組合設(shè)計用于植物內(nèi)生菌分離時的表面消毒是可行而有效的，方法簡便、安全、有效，既不對植物內(nèi)生真菌造成過度傷害，也避免了植物體外附生菌的混雜。如，李曉紅等[7]比較了不同的表面消毒方法對真菌出菌率的影響，結(jié)果表明用NaClO進行表面消毒，真菌的出菌率相對較高。姜國銀等[6]比較了5種消毒劑的植物表面消毒效果，發(fā)現(xiàn)用75％乙醇溶液消毒1～2 min，4％ 或6％ NaClO消毒0.5～2 min都能從核桃樹以及飛龍斬血植株樣品中獲得較多的內(nèi)生菌。在以往從紅豆杉分離內(nèi)生真菌的研究中，僅采用70％乙醇表面消毒或70％乙醇表面消毒結(jié)合含抗生素的培養(yǎng)基，分離得到了一些內(nèi)生真菌菌株[12～15]，但表面消毒效果差異還可能影響到后續(xù)內(nèi)生菌分離鑒定的工作量，因此有必要尋找既能夠徹底表面消毒，又不影響內(nèi)生真菌的方法。本實驗獲得了適用于南方紅豆杉內(nèi)生真菌分離時的表面消毒方法，并發(fā)現(xiàn)消毒劑的處理時間對于從植株不同組織器官分離內(nèi)生菌非常關(guān)鍵。不同植物、植物的不同器官以及內(nèi)生菌的類別(真菌、細菌和放線菌)對消毒劑的敏感性不一樣，對消毒劑的耐受時間也是有差異的，因此分離植物內(nèi)生菌時應(yīng)該根據(jù)實驗?zāi)康?、所用材料篩選出最佳的表面消毒方法。

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