王世鋒, 李 靜, 王玉濤

喀什師范學(xué)院生物與地理科學(xué)系, 葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆 喀什 844006

綿羊(Ovisaries)是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一，為人類社會(huì)提供了大量的產(chǎn)品(如，肉、奶和羊毛纖維等)，同時(shí)也是人類馴養(yǎng)最早的動(dòng)物之一[1]。

過去關(guān)于家養(yǎng)綿羊起源與進(jìn)化研究主要依靠比較形態(tài)學(xué)、考古形態(tài)學(xué)和經(jīng)典遺傳學(xué)方法。近年來，分子遺傳學(xué)和生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，推動(dòng)了家養(yǎng)動(dòng)物起源的全基因組研究；而考古證據(jù)的進(jìn)一步挖掘以及古DNA技術(shù)的不斷發(fā)展，擺脫了相關(guān)研究的時(shí)空、時(shí)序限制，推動(dòng)了家養(yǎng)綿羊起源進(jìn)化研究的進(jìn)展[2]。

在距今大約8 000～9 000年前(新石器時(shí)代)，人類開始馴養(yǎng)綿羊[3]?？梢?，家養(yǎng)動(dòng)物的馴化(馴化和馴養(yǎng))是較近期的遺傳事件，所以分子遺傳標(biāo)記選擇上應(yīng)具有進(jìn)化速率快、多態(tài)性高的基本特點(diǎn)。目前，分子遺傳標(biāo)記研究主要包括基于mtDNA遺傳標(biāo)記研究，基于父系遺傳特征的Y染色體研究和基于核基因組的微衛(wèi)星標(biāo)記研究。

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是核外遺傳物質(zhì)，具有分子量小、進(jìn)化速度快(mtDNA的突變速率是核DNA進(jìn)化速率的5～10倍)、遺傳自主(無(wú)重組)、無(wú)組織特異性及嚴(yán)格的母系遺傳等特性，在近緣種間和種內(nèi)群體間具有豐富的多態(tài)性，是研究物種起源進(jìn)化和分類的重要分子遺傳標(biāo)記之一[4,5]。綿羊線粒體基因組長(zhǎng)約16 600 bp，編碼線粒體氧化磷酸化呼吸鏈組成酶所必需的13種多肽、12S rRNA、16S rRNA和 22個(gè)tRNA，而其中位于編碼脯氨酸t(yī)RNA和苯丙氨酸t(yī)RNA之間的長(zhǎng)約1 182 bp的mtDNA-環(huán)控制區(qū)(mtDNA D-loop)是線粒體基因組中進(jìn)化速率最高、最具多態(tài)性的區(qū)域[6,7]。mtDNA D-loop分為三個(gè)部分，分別為左功能區(qū)、中間保守區(qū)和右功能區(qū)，其中左右功能區(qū)富含A堿基，在遺傳上為高變區(qū)。環(huán)控制區(qū)受自然選擇影響較大，存在巨大的變異，如插入、缺失，是整個(gè)線粒體基因組序列組成和長(zhǎng)度變異最大的區(qū)域，其進(jìn)化速度最快，常用于種群間的系統(tǒng)進(jìn)化分析[8～10]。通過測(cè)定家養(yǎng)綿羊群體的線粒體D-loop區(qū)的部分序列，預(yù)期能了解家養(yǎng)綿羊的野生祖先、起源以及馴化時(shí)間等核心問題，分析現(xiàn)代家養(yǎng)綿羊的起源與品種形成以合理保護(hù)和持續(xù)利用種質(zhì)資源，對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有重要意義[11]。

mtDNA D-loop在研究牛[12]、豬[13]、馬[14]和山羊[15]等畜種起源中應(yīng)用較多，然而對(duì)于綿羊的起源與進(jìn)化涉及較少。Wood和Phua[16]分析了新西蘭5個(gè)綿羊品種的mtDNA D-loop序列，發(fā)現(xiàn)了兩類主要的單倍型(定義為A和B)，從而證明新西蘭家養(yǎng)綿羊有兩個(gè)不同的母系起源。Hiendleder等[17]對(duì)3個(gè)中亞、5個(gè)歐洲和2個(gè)非洲綿羊品種的239只個(gè)體進(jìn)行了mtDNA的RFLP測(cè)定，也只發(fā)現(xiàn)了這兩類單倍型。張仲葛[18]、謝成俠[19]認(rèn)為阿爾卡羊(赤盤羊)和盤羊及其若干亞種與中國(guó)現(xiàn)代家養(yǎng)綿羊最可能有血緣關(guān)系；常洪[20]認(rèn)為烏利爾羊、盤羊和摩弗倫羊?qū)χ袊?guó)綿羊血統(tǒng)均有貢獻(xiàn)；羅玉柱等[5]對(duì)中國(guó)9個(gè)綿羊群體和蒙古24個(gè)綿羊群體的mtDNA D-loop序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示中國(guó)和蒙古綿羊均有3個(gè)母系起源，對(duì)91個(gè)綿羊品種的進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析，沒有發(fā)現(xiàn)羱羊、盤羊和東方盤羊?qū)χ袊?guó)和蒙古兩國(guó)家養(yǎng)綿羊有遺傳貢獻(xiàn)的證據(jù)；線粒體細(xì)胞色素b基因序列分析則表明，中國(guó)綿羊有多個(gè)母系起源或經(jīng)過多次馴化而來，但未發(fā)現(xiàn)盤羊、東方盤羊和亞洲摩佛倫羊與綿羊的母系祖先形成有關(guān)的分子證據(jù)[21]。

多浪羊(Dolang sheep)是新疆的一個(gè)優(yōu)良肉脂兼用型綿羊品種，因其中心產(chǎn)區(qū)在麥蓋提縣，故又稱麥蓋提羊。麥蓋提羊是當(dāng)?shù)赝练N羊(多浪羊)與阿富汗引進(jìn)的瓦格吉爾羊雜交，經(jīng)過麥蓋提縣當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民近百年的精心選育而成，具有較高經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值[22，23]。多浪羊適宜舍飼喂養(yǎng)，體格高大粗壯、生長(zhǎng)發(fā)育快、產(chǎn)肉率高且肉質(zhì)鮮嫩，被毛含絨毛多，毛質(zhì)較好，性情溫順，繁殖率高，遺傳性穩(wěn)定，是羊肉生產(chǎn)的理想品種[24]。本研究以多浪羊?yàn)檠芯繉?duì)象，采取PCR擴(kuò)增、基因測(cè)序方法研究其線粒體D-loop區(qū)核酸序列，探討多浪羊的起源和遺傳多樣性，以期為綿羊品種的分類提供合理的依據(jù)，同時(shí)也為家養(yǎng)綿羊遺傳資源的保護(hù)和利用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1供試材料

多浪羊樣本總量82只(麥蓋提縣種羊場(chǎng)32只、麥蓋提獸醫(yī)站20、喀什屠宰場(chǎng)30只)，為雄性個(gè)體。頸靜脈采血，每10 mL血液加入1.75 mL ACD抗凝劑，混勻后1 h內(nèi)放入-20℃冰箱中保存，備用[25]。

1.2主要試劑

Tris飽和酚購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心；瓊脂糖為BIOWEST公司產(chǎn)品；TaqDNA聚合酶、dNTP為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.3總DNA提取

采用酚-氯仿常規(guī)法提取樣品總DNA[26]。

1.4mtDNAD-loop序列分析

綿羊mtDNA D-loop區(qū)擴(kuò)增所用引物根據(jù)綿羊線粒體全序列(GenBank登錄號(hào)：AF010406.1)設(shè)計(jì)。上游引物(位于15 983～16 004 bp)mtCR-F：5′-AACTGCTTGACCGTACATAGT-3′；下游引物(位于592～612 bp)mtCR-R：5′-AGAAGGGTATAAAGCACCGCC-3′。由北京三博遠(yuǎn)志公司合成。PCR反應(yīng)體系總體積50 μL：綿羊總基因組DNA 4 μL，6×buffer(含Mg2+)5 μL， 上下游引物各1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，TaqDNA 聚合酶1 μL，ddH2O 34 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 40 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳檢測(cè)后送北京三博遠(yuǎn)志公司測(cè)序。

1.5數(shù)據(jù)分析

MEGA 6.0軟件確定計(jì)算堿基組成、轉(zhuǎn)換/顛換比(Ts/Tv)、核苷酸差異和序列差異、Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離、建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

用DNAsp軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)、核苷酸總變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和點(diǎn)突變位點(diǎn)，單倍型、單倍型頻率及其在各群體的分布、群體的單倍型多樣性及其標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)多浪羊mtDNA D-loop區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約1 100 bp片段，產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖1。經(jīng)測(cè)序分析，片段長(zhǎng)1 039 bp，確定為目標(biāo)產(chǎn)物。

2.2多浪羊mtDNAD-loop的核苷酸組成

對(duì)多浪羊mtDNA D-loop區(qū)序列進(jìn)行測(cè)序，所測(cè)mt DNAD-loop區(qū)的序列長(zhǎng)度為1 039 bp。通過對(duì)82個(gè)多浪羊個(gè)體mtDNA D-環(huán)區(qū)堿基組成分析，發(fā)現(xiàn)A、T、G和C堿基含量分別為29.4％、27.7％、17.7％和25.1％，其中A+T為57.1％，G+C為42.8％。并且對(duì)不同采集地的堿基含量進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)麥蓋提縣種羊場(chǎng)的多浪羊G+C含量較其他采集地的要高(見表1)。

2.3多浪羊mtDNAD-loop區(qū)序列多樣性分析

對(duì)多浪羊群體的82個(gè)個(gè)體 mtDNA D-loop序列進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)56個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。在 56個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中，單一多態(tài)位點(diǎn) (只有一個(gè)序列在該位點(diǎn)出現(xiàn)了變異)有42個(gè)，其中兩堿基變異位點(diǎn)有39個(gè)，占變異位點(diǎn)數(shù)的 69.64％，三堿基變異位點(diǎn)3個(gè)，占變異位點(diǎn)數(shù)的5.36％。簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)有14個(gè)，其中兩堿基變異位點(diǎn) 13個(gè)，三堿基變異位點(diǎn) 1個(gè)。

2.3.1mtDNA D-loop區(qū)序列轉(zhuǎn)換/顛換 在56 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中，轉(zhuǎn)換與顛換比例見表2，C轉(zhuǎn)換為T的比例最高，為31.84；T轉(zhuǎn)換為C的比例為31.65，較高；T顛換為G的比例最低，為1.29?？梢悦黠@看出轉(zhuǎn)換比例高于顛換比例，這可能與堿基的結(jié)構(gòu)有關(guān)。轉(zhuǎn)換與顛換比值為6.626。

2.3.2mt DNA D-loop序列單倍型 本實(shí)驗(yàn)獲得82只多浪羊的mtDNA D-loop序列，共發(fā)現(xiàn)了26種單倍型，單倍型比例較低，說明這3個(gè)綿羊群體序列遺傳多樣性較單一。單倍型多樣度Hd為0.892，方差為0.000 43，單倍型多樣度標(biāo)準(zhǔn)差為0.021。平均核苷酸差異數(shù)k為5.289。核苷酸多樣度Pi為0.024 15。

圖1 多浪羊mt DNA D-loop區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

表1 不同采集地多浪羊mtDNA D-loop堿基組成比較

表2 mtDNA D-loop區(qū)序列轉(zhuǎn)換/顛換

2.4系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)綿羊母系起源世系判定標(biāo)準(zhǔn)：亞洲A世系(AF039578、AY829405)、歐洲B世系(AF039577、AY829403)和中亞C世系(AY829404)[27]，分析多浪羊起源及單倍型分布。

通過對(duì)82個(gè)序列與5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)相比較建立系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖2)。

由圖2可知，多浪羊的起源可能來自于A、B和C三個(gè)世系。其中A世系占26.8％，B世系占28.01％，C世系占 29.3％，剩下12只羊可能來自獨(dú)立的一個(gè)分支D或E世系，占15.9％。

2.5群體擴(kuò)張檢測(cè)

應(yīng)用DnaSP軟件對(duì)82只多浪羊進(jìn)行中性檢驗(yàn)(Tajima’s D)：-1.842 60，顯著性水平，P<0.05，及Fu和Li氏檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量(Fu and Li′s F*test statistic)：-5.238 57，顯著性水平P<0.02，由此可知多浪羊群體經(jīng)歷過擴(kuò)張。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所獲得的82 條多浪羊mtDNA D-loop序列，共發(fā)現(xiàn)了26種單倍型，56個(gè)變異位點(diǎn)，其中單一多態(tài)位點(diǎn)有42個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)有14個(gè)。轉(zhuǎn)換比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于顛換比例，綿羊品種間的堿基存在較高的轉(zhuǎn)換偏倚，這符合線粒體基因組DNA進(jìn)化過程中，通常發(fā)生轉(zhuǎn)換頻率遠(yuǎn)高于顛換頻率的規(guī)律。通過對(duì)82只綿羊個(gè)體mtDNA D-loop 區(qū)序列核苷酸A、C、T和G堿基含量分析發(fā)現(xiàn)，以A、T 含量占優(yōu)勢(shì)，說明綿羊mtDNA D-loop為A、T富集區(qū)，可能是由于CG含量越豐富序列越趨于穩(wěn)定，而mtDNA D-loop變異率較高。Li 等[28]研究發(fā)現(xiàn)GC含量與系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)，親緣關(guān)系接近的動(dòng)物可能有著類似的GC含量。脊椎動(dòng)物的基因組GC含量相當(dāng)一致，在40％～45％的范圍中，本研究結(jié)果為42.8％，符合這一規(guī)律，這說明它們相互分岐的時(shí)間還不夠長(zhǎng)，所以還不能在GC含量上積累較大的差異。

核苷多樣度Pi是衡量一個(gè)種群mtDNA遺傳變異的重要指標(biāo)。本研究表明多浪羊核苷酸多樣度為0.024 15，雖高于牛華鋒等[29]研究的0.014 75，但多浪羊的核苷酸多樣度仍較低，說明多浪羊純度較高，但多樣性較低、親緣關(guān)系較近，可能由于長(zhǎng)期閉鎖繁育的結(jié)果，應(yīng)采取重點(diǎn)措施予以保護(hù)。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明多浪羊至少有A、B和C三個(gè)母系起源，另外可能還存在獨(dú)立的一個(gè)分世系D或E，但還需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

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