陶維紅, 秦民民, 張哲如

上海津曼特生物科技有限公司, 上海 201210

20世紀80年代初，基因重組技術開始應用于動物細胞。1984年，Genentech公司首次實現重組中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞表達組織型纖溶酶原激活劑(tissue type plasminogen activator，t-PA)，標志著哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的建立[1]。隨后，許多外源蛋白基因相繼被轉染到哺乳動物細胞，一些有價值的蛋白不斷實現表達，包括凝血因子、促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)、免疫球蛋白、尿激酶(urokinase，UK)、乙肝表面抗原(HBsAg)和單克隆抗體[2]等。近幾年，平均每年有15種以上重組蛋白新藥通過美國食品和藥物管理局(FDA)批準[3]，并且?guī)讉€重磅生物抗體藥專利即將到期促使生物仿制藥的出現，全球生物抗體藥銷售額已超過1 200億美元/年[4]，預計到2015年，全球生物抗體藥銷售額將超過1 500億美元[5]。最突出的重磅炸彈級藥物包括：美羅華利妥昔單抗[Rituximab(Ritaxan)，美國Genentech和Biogen Idec公司研制]、赫賽汀曲妥珠單抗[Trastuzumab(Herceptin)，美國Genentech公司研制]、阿伐斯汀貝伐單抗[Bevacizumab(Avastin)，美國Genentech公司研制]、艾比特思西妥昔單抗[Cetuximab(Erbitux)，美國ImClone公司和Bristol-Myers Squibb公司研制]和修美樂阿木達單抗[adalimumab(Humira)，美國Cambridge抗體公司和AbboR公司研制]，這幾種單抗藥物在2011年全球銷售額分別都在近50億美元以上[6]。在國內，生產單抗藥物的上市公司目前僅僅有上海的中信國建、賽金和北京的百泰，國內市場空間巨大，很多從事小分子藥物或者中藥的企業(yè)已經進軍單抗藥物領域，包括海正藥業(yè)、復星醫(yī)藥、榮昌制藥、麗珠藥業(yè)和沃森藥業(yè)等。最近幾年，單抗藥物領域中小型企業(yè)也應運而生，其中不具備單抗藥物研發(fā)平臺的企業(yè)在初始階段會考慮技術外包，于是藥明康德、睿智化學等生物醫(yī)藥研發(fā)外包公司(contract research organization，CRO)也進入單抗藥物研發(fā)、生產等領域。但是我國動物細胞表達水平較低和發(fā)酵規(guī)模普遍偏小的現狀制約了我國抗體藥物產業(yè)化的發(fā)展。因此有必要對國內細胞株開發(fā)技術策略進行探討。

1 宿主細胞

抗體藥物生產的宿主細胞主要有NS0、HEK293、Hybridoma、SP2/0和CHO等[7]。其中，CHO細胞是生產抗體藥物應用最廣的宿主細胞[8]，主要有以下原因[3]：①CHO細胞能夠較好地適應懸浮培養(yǎng)，在生物反應器中可獲得較高的密度，有利于工業(yè)上大規(guī)模培養(yǎng)；②CHO細胞不易傳播人類感染病毒[9]；③CHO細胞能夠在無血清和化學成分明確的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能夠確保不同批次培養(yǎng)的重現性；④CHO細胞能夠在翻譯后進行修飾[10]，尤其是在糖蛋白糖基化方面，其糖型與人類基本一致；⑤dhfr和GS等基因能夠在CHO細胞實現共擴增，并最終獲得目的蛋白的高表達。此外，CHO細胞類型也比較多，例如：DG44、DXB11、CHO K1和CHO-S等。自20世紀80～90年代開始，工業(yè)上較早使用的是DHFR(二氫葉酸還原酶缺陷型)基因擴增篩選系統(tǒng)，宿主細胞株為DG44[11～13]。當細胞培養(yǎng)基內含有甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)時，二氫葉酸還原酶被抑制，通過反饋調節(jié)，使得該基因進行擴增[14]，其上下游100～1 000 kb范圍內的基因都會隨之擴增，因此將目的基因插入此位點范圍即可得到擴增?，F在很多單抗生產的體系依然是DG44的DHFR體系。GS(谷氨酰胺合成酶)擴增系統(tǒng)，以CHO-K1為宿主細胞，是近些年發(fā)展的一種新型基因擴增篩選系統(tǒng)，較DHFR系統(tǒng)有明顯的優(yōu)越性，目前在國際上得到了廣泛的認可[15～17]。其原理是GS在ATP水解提供能量的同時，利用細胞內的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺。在缺乏外源谷氨酰胺的培養(yǎng)基中加入GS抑制劑甲硫氨酸亞砜亞銨(L-methioninesulfoximine，MSX)，可使GS基因及與之相連的目的基因得到有效擴增，從而達到提高目的基因表達水平的目的。該系統(tǒng)的優(yōu)點主要在[17]：不需要基因缺陷型的CHO-K1細胞株作為宿主細胞；CHO-K1細胞易于培養(yǎng)，更強壯；在培養(yǎng)基中無需加谷氨酰胺，能夠避免谷氨酰胺分解造成培養(yǎng)體系中氨水平高的問題，降低了工藝控制的難度，并且可有效提高細胞發(fā)酵密度和延長細胞生存時間。

2 表達載體的構建與轉染策略

適合于CHO細胞表達的載體(Vector)的基本元素包括：啟動子(promoter)、poly A 加尾信號(poly A signal)、篩選標記(selectable marker)、克隆位點(cloning site)和復制起始位點(origin of replication)，有些還有報告基因(reporter gene)。啟動子一般較多采用SV40和CMV兩種，CMV啟動子通常位于目的基因(輕鏈和重鏈可變區(qū)基因)之前，而SV40則位于篩選標記之前。篩選標記一般有兩種：代謝型和抗生素型，或者也可稱為擴增型基因篩選標記和非擴增型基因篩選標記。常見的篩選標記見表1，當前工業(yè)界較多采用的篩選標記為DHFR、GS、G418和puromycin等。

表1 哺乳動物細胞表達載體中常用的篩選標記

Li等[18]研究顯示，在載體設計中插入篩選標記的不同策略，會影響最終的篩選結果。為比較不同質粒構建和篩選策略，分別設計了兩種質粒，一種帶有DHFR單個篩選標記， 另一種帶有GS單個篩選標記，兩種質粒都同時具有輕鏈和重鏈基因。共進行五組實驗：Ⅰ轉染質粒一，加入25 nmol/L MTX進行篩選；Ⅱ轉染質粒二，加入25 μmol/L MSX進行篩選；Ⅲ轉染質粒二，加入50 μmol/L MSX進行篩選；Ⅳ混合轉染兩種質粒，加入25 nmol/L MTX和25 μmol/L MSX進行篩選；Ⅴ混合轉染兩種質粒，加入25 nmol/L MTX和50 μmol/L MSX進行篩選。比較上述轉染后的篩選結果顯示，Ⅳ和Ⅴ條件篩選的高表達的克隆數量明顯較高。因此，這種采用兩種篩選標記的質粒構建與篩選方法又稱雙重篩選(double selection)，比單篩選標記的質粒轉染后篩選效率高很多。

目前，商業(yè)中所選擇的載體供應商主要是Life technologies公司，從pcDNA3系列到Freedom pCHO1.0，其大小由原來的4 000～5 000 bp到現在的近13 000 bp不等。圖1～圖3分別顯示了三種典型的載體圖譜(均來自www.lifetechnologies.com)。pcDNA3.1是Life technologies公司早期開發(fā)的載體，其構造相對較簡單。pOptiVEC-TOPO載體的最大特點在于具有TOPO酶和IRES(internal ribosome entry site)組件。TOPO酶具有無縫克隆的特點，與多克隆位點相比，優(yōu)勢在于插入目的基因時不會帶有酶切位點；而IRES組件的功能主要是能夠將它所連接的兩個基因共用同一個啟動子進行表達[3]，即pOptiVEC-TOPO(4 420 bp)上的CMV啟動子同時作用于目的基因和DHFR篩選標記基因。Freedom pCHO1.0是Life technologies最新開發(fā)的一個載體，大小為12 988 bp，具有以下特點：①目的基因的輕鏈和重鏈可以同時插入一個載體上，以前的載體設計多數是插入一個輕鏈或者重鏈；②外源基因插入位點之前設計的啟動子在CMV基礎上進行了較大的改善；③具有兩個篩選標記。在啟動子的設計上面，尤其是對于使用DHFR或GS這類擴增型基因篩選標記的表達體系，目的基因前面的啟動子一般比篩選標記的啟動子轉錄活性要強[19]。

圖1 pcDNA3.1圖譜

圖2 pOptiVEC-TOPO圖譜

圖3 Freedom pCHO1.0圖譜

3 轉染方法

轉染類型一般有穩(wěn)定轉染和瞬時轉染兩種。在單抗細胞株篩選穩(wěn)定轉染前通常通過瞬時轉染得到一些抗體，進行質量分析，以初步判斷抗體是否滿足需要；或者進行一些前期的啟動子、密碼子等組件的優(yōu)化。穩(wěn)定轉染中外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體存在。在CHO細胞中進行穩(wěn)定轉染時，外源DNA整合到CHO染色體上，未整合的游離態(tài)的DNA會隨傳代而丟失。

常用于哺乳動物細胞轉染的方法有磷酸鈣法、陽離子脂質體法、陽離子聚合物法和電穿孔法，在工業(yè)界使用最多的是陽離子脂質體法和電穿孔法[18]。

4 篩選技術

CHO細胞轉染之后，通常會做一個克隆池(pool)，然后進行篩選。篩選策略主要涉及抗生素或藥物的代謝途徑，常見的篩選試劑包括puromycin、G418、MTX和MSX等。Puromycin為氨基糖甙類抗生素，通過干擾核糖體功能阻斷哺乳動物細胞的蛋白質合成，來自鏈霉菌的pac基因具有解除嘌呤霉素(puromycin)毒性的作用。在篩選的時候，puromycin濃度一般在10 ～50 μg/mL。G418也是一種氨基糖苷類抗生素，是穩(wěn)定轉染最常用的抗性篩選試劑之一。G418在篩選的時候一般濃度范圍為200～1 000 μg/mL。MTX為葉酸拮抗劑，在細胞內經過轉換后可抑制DHFR的活性，抑制核酸合成，引起細胞毒性。Schimke等[14]的研究顯示，隨著MTX濃度的增加，絕大多數細胞死亡，但在極少數幸存下來的抗性細胞中，DHFR基因得以擴增，目的基因拷貝數隨之增加，提高了表達量。MTX篩選時，一般濃度范圍為25～1 000 nmol/L。MSX篩選采用的是谷氨酰胺合成酶基因GS系統(tǒng)壓力。谷氨酰胺合成酶(GS)擴增系統(tǒng)是新近發(fā)展的更有效的系統(tǒng)，具有更高的擴增效應。MSX篩選時，一般濃度范圍：25～500 μmol/L。

4.1篩選方法

哺乳動物細胞篩選穩(wěn)定的細胞株常用的方法主要有三種：96孔單克隆有限稀釋法[20]、流式細胞儀法[21]和Clone Pix System篩選法[22]。

96孔單克隆有限稀釋法是早期最廣泛應用的單克隆細胞株篩選法，理論上可以得到非常均一的單克隆，同時可以篩選懸浮細胞穩(wěn)定株。其缺點是工作量比較大,效率較低。流式細胞儀法主要針對膜蛋白或者內分泌抗體，具有一定的局限性[3]。流式細胞儀可同時進行多參數測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。在應用中，通常細胞目的基因帶有熒光報告蛋白基因或者加入帶有熒光標記的抗抗體。

Clone Pix System篩選法是目前工業(yè)上較為流行的篩選法[3]，是由Molecular Devices公司開發(fā)的自動挑選克隆的設備，較有限稀釋法具有更高篩選效率(表2)。該方法使用半固體培養(yǎng)基，將細胞固定在半固體培養(yǎng)基中進行生長，并在半固體培養(yǎng)基中加入帶有熒光標記的二抗，通過與細胞表達的抗體進行結合，形成熒光光圈，在熒光顯微鏡下可以看出所謂的“光暈”。如果光暈越大、熒光強度越強，理論上說明克隆表達量越高，也即篩選所得的克隆。Clone Pix System儀器主要結合這一原理，能夠快速挑選高表達的單一克隆。與其配套的Clone Select Imager儀器可以客觀定量評估孔板中的細胞生長，判斷是否是單個克隆。最近出現了與Clone Pix System類似的篩選儀器，是德國ALS(Automated Lab Solutions)公司開發(fā)的Cell Celector[23]，應用范圍更廣。

表2 有限稀釋法和Clone Pix System方法比較

在工業(yè)上，單克隆細胞大部分是懸浮培養(yǎng)，所以在篩選細胞株的時候，應該盡量接近工業(yè)生產條件。結合實踐經驗來看，在篩選細胞株早期，應該考慮將細胞靜止培養(yǎng)轉向搖床或者動態(tài)培養(yǎng)，以便篩選出更為穩(wěn)定的、接近生產型的細胞株。篩選穩(wěn)定、高表達的細胞株，一般周期需要6～12個月。

4.2篩選準則以及檢測方法

克隆的篩選通常關注滴度水平及單位時間單個細胞所表達的抗體量(cell specific productivity，Qp)選擇克隆的Qp在所有克隆中至少要排在中等。工業(yè)上所用的克隆Qp一般在20～100 pg/cell·d。同時還要關注克隆生長狀態(tài)，工業(yè)上CHO細胞的翻倍時間一般為15～24 h，在批次培養(yǎng)或者流加培養(yǎng)的時候，平臺期能夠盡量長些。

在孔板期間滴度的檢測一般通過ELISA方法或者均相時間分辨熒光技術(homogeneous time resolved fluorescence，HTRF)[24]，后者是目前高通量篩選克隆常用的檢測方法。HTRF技術是對時間分辨熒光共振能量轉移的檢測技術(time-resolved fluoresence resonance energy transfer assay，TR-FRET assay)平臺的進一步改良，可提供更高的靈敏度和穩(wěn)定性。該技術是法國Cisbio Bioassays公司的專利技術。最近又有一種新的微量檢測方法出現，該方法稱為ForteBio Octet分析法[25]，采用生物膜干涉技術，與ELISA法相比，Octet平臺自動化程度高，測定的速度快，更貼近搖瓶和反應器中細胞表達量測定的試驗需要，但其費用可能偏高，暫時沒有在測定孔板滴度中得到廣泛的應用。

篩選的克隆到達搖瓶之后，應盡快建立研究型細胞庫(research cell banking,RCB)，做穩(wěn)定性試驗。考察克隆的穩(wěn)定性一般會傳代至60代，并觀察克隆生長的穩(wěn)定性，即翻倍時間的穩(wěn)定性；克隆表達的穩(wěn)定性，即滴度或者Qp的穩(wěn)定性；克隆遺傳的穩(wěn)定性；以及克隆質量的穩(wěn)定性，即克隆前后表達抗體的質量是否有較大差別?？寺∵M入搖瓶的同時，還會進行cDNA序列的鑒定、肽圖分析、CE-SDS和SDS-PAGE單抗純度分析等，主要為避免抗體氨基酸序列突變或克隆的丟失；進行HPLC-SEC分析，以剔除容易形成多聚體的克隆；進行糖型分析，盡量避免一些糖型較差的克??；進行等電聚焦電泳(isoelectric focusing electrophore-sis，IEF)或者成像毛細管等電聚焦電泳(imaged capillary isoelectric focusing，iCIEF)，以及離子交換色譜HPLC分析，避免一些產生高酸或高堿變體的克隆等。

克隆在搖瓶考察后，需要選定一定數量的克隆進入反應器進行評價，主要考察細胞生長、單抗表達和單抗質量等。一般篩選克隆會做1～2次亞克隆，以確保是單克隆。當然如果在初期母克隆篩選的時候能夠確保是單克隆，可以不做亞克隆。

5 培養(yǎng)工藝

細胞株開發(fā)的過程中，一般需要在一定的培養(yǎng)工藝平臺基礎上進行克隆篩選。中試生產申報藥品臨床試驗(investigational new drug，IND)時，一般會選定2～3個來自不同系列的克隆，其中1～2個克隆作為備選。

培養(yǎng)工藝對最終生物制品的產量、質量和安全有巨大影響，其中以細胞培養(yǎng)基的選擇最為重要[7]。在篩選培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基時，初期流加培養(yǎng)時候基礎培養(yǎng)基和同品牌的補料培養(yǎng)基應該配對進行篩選。初步篩選之后，將基礎培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基進行分類，如促進生長類型、維持活率類型、促進表達類型等。將培養(yǎng)基進行混合優(yōu)化時，盡量將不同類型的培養(yǎng)進行組合，并且應用實驗設計(design of experiment，DOE)優(yōu)化。

在補料策略方面，普遍將基礎培養(yǎng)進行濃縮后添加到補料培養(yǎng)基中，因為基礎培養(yǎng)基一般營養(yǎng)比較全面，但也有可能導致滲透壓偏高。一般來講，補料體積應該在終體積的40％以內。有的策略會按照天數和一定的補料體積來補加，有的會按照細胞密度來補加，也有按照葡萄糖濃度來補加，或者按照一定代謝狀態(tài)補加等。

6 展望

目前中國抗體藥物產業(yè)正進入關鍵的發(fā)展時期，在細胞株開發(fā)方面需要不斷堅持自主創(chuàng)新，吸取國外先進的技術，結合自身發(fā)展需要，選擇CHO K1或者CHO-S為宿主細胞、谷氨酰胺合成酶表達體系，結合Clone Pix System半固體培養(yǎng)基方式挑選克隆，利用商業(yè)培養(yǎng)基快速推進IND申報，同時開發(fā)自己的培養(yǎng)基和細胞培養(yǎng)工藝平臺模式，選擇合適的產業(yè)化方式，促使整個抗體藥物產業(yè)健康發(fā)展。

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