鄧 龍, 周 思, 郭新東

1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院, 廣州 510520;

2.廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院, 廣州 510000

隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，通過DNA重組技術(shù)獲得抗體的基因片段，將重組抗體的基因轉(zhuǎn)入原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中在適當(dāng)條件下表達(dá)，已獲得一系列基因工程重組抗體?；蚬こ讨亟M抗體是繼多克隆抗體和單克隆抗體之后的第三代抗體。其在基因水平上的操作非常靈活?？蓪蛐蛄羞M(jìn)行分析、修飾和加工以改進(jìn)抗體特性或賦予抗體新的特性，突破以往僅局限于半抗原分子設(shè)計(jì)的限制。針對基因工程抗體親和力普遍較低；半衰期短，易從血中清除；缺乏Fc片段，只能中和抗原，而不能激活補(bǔ)體系統(tǒng)和介導(dǎo)細(xì)胞免疫等缺點(diǎn)，人們希望通過基因工程抗體的靈活性，將抗體進(jìn)行定向的改造，達(dá)到優(yōu)化抗體的目的。

近年來，利用信息技術(shù)剖析生命現(xiàn)象的本質(zhì)成為生命科學(xué)工作者所關(guān)注的焦點(diǎn)，也由此產(chǎn)生了一門計(jì)算機(jī)技術(shù)與生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的新興學(xué)科——生物信息學(xué)。要實(shí)現(xiàn)基因工程抗體的定向進(jìn)化需要充分利用計(jì)算機(jī)模擬、X射線衍射(X-ray)、多維核磁共振(multidimentional NMR spectroscopy)等結(jié)構(gòu)測定技術(shù)，通過生物信息學(xué)手段分析小分子有機(jī)物與抗體相互作用機(jī)制，在此基礎(chǔ)上對抗體的基因序列進(jìn)行修飾、改造，從而達(dá)到改進(jìn)基因工程抗體的目的。

基因工程抗體要進(jìn)行體外抗體親和力成熟，就必須對體內(nèi)抗體親和力成熟原理有深入認(rèn)識(shí)，模擬親和力成熟過程中體內(nèi)存在的變化，促使基因工程抗體的體外進(jìn)化，才是解決問題的關(guān)鍵[1]。

1 小分子有機(jī)物—抗體相互作用機(jī)制分析

隨著抗體信息學(xué)的廣泛開展，現(xiàn)已經(jīng)有幾種專門針對抗體序列進(jìn)行分析的數(shù)據(jù)庫及分析工具，如Kabat數(shù)據(jù)庫、NCBI數(shù)據(jù)庫里的Immunoglobin BLAST (IgBlast)、VBASE數(shù)據(jù)庫，以及IMGT數(shù)據(jù)庫等。研究者可在獲得抗體序列的基礎(chǔ)上，利用這些數(shù)據(jù)庫及相應(yīng)的分析工具進(jìn)行序列比對以及其他特征的分析。與此同時(shí)，在計(jì)算機(jī)模擬平臺(tái)上，研究抗原和抗體的相互作用機(jī)制，特別小分子有機(jī)物和相應(yīng)的抗體的相互作用機(jī)制已經(jīng)受到了相當(dāng)大的關(guān)注[2～4]。近年來，借助同源模建(homology modelling)及X射線衍射手段獲取抗體模型，并利用分子動(dòng)力學(xué)、定點(diǎn)突變等技術(shù)已經(jīng)對多種小分子有機(jī)物和相應(yīng)抗體的相互作用機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)的研究(見表1)[5～13]，揭示了小分子有機(jī)物和相應(yīng)抗體的相互作用本質(zhì)。

抗原與抗體間的特異性結(jié)合，可用“模板學(xué)說”或“鎖與鑰匙學(xué)說”來描述[14，15]。通過分子生物學(xué)與X射線衍射、多維核磁共振(NMR)等相結(jié)合的大分子結(jié)構(gòu)測定技術(shù)，許多抗體大分子或者抗體-抗原復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)己被測定[16，17]。而對已知一級結(jié)構(gòu)的抗體分子，可采用理論方法、分子模擬方法(如同源蛋白模建方法)預(yù)測其三維結(jié)構(gòu)[18]。目前應(yīng)用較多的在線同源模建工作站有SWISS-MODEL、web of antibody model和Rosetta antibody model server等。獲得抗體模型后，借助各種手段來闡明抗原抗體識(shí)別機(jī)制，可以指導(dǎo)小分子有機(jī)物特異抗體的制備，如交叉反應(yīng)的避免和抗體親和力的提高等。Hofstetter等[19]分別將氨基酸異構(gòu)體衍生化后得到的抗原注入動(dòng)物體內(nèi)而培養(yǎng)出相應(yīng)的抗氨基酸的抗體，再將得到的對映異構(gòu)體的抗體用來識(shí)別該氨基酸異構(gòu)體。而在抗體親和力的提高上，Scotti等[20]通過分析兩個(gè)不同親和力的抗苯基唑酮抗體的基因序列，發(fā)現(xiàn)高親和力抗體和低親和力抗體的序列基本相同，只存在9個(gè)氨基酸殘基的差異，這些氨基酸殘基差異都位于抗體的重鏈區(qū)。通過X射線衍射對抗原與抗體結(jié)合體進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)表面互補(bǔ)性提高使抗體獲得了較高的親和力，這意味著表面互補(bǔ)性對抗體親和力的成熟具有重要的作用。

表1 抗體與小分子相互作用機(jī)制研究

2 基因工程抗體的親和力成熟研究

抗體的親和力一般用親和常數(shù)Ka或者解離常數(shù)Kd來表示，可以反映抗原和抗體的結(jié)合程度?？贵w親和力成熟(antibody affinity maturation) 是指機(jī)體正常存在的一種免疫功能狀態(tài)。在體液免疫中，再次應(yīng)答所產(chǎn)生抗體的平均親和力高于初次免疫應(yīng)答，這種現(xiàn)象稱為抗體親和力成熟。這是由于抗體形成細(xì)胞本身的基因突變和抗原對B 細(xì)胞克隆的選擇性激活。機(jī)體的這種功能狀態(tài)是長期進(jìn)化和對外界環(huán)境不斷適應(yīng)的結(jié)果，對機(jī)體防御和維持自身免疫監(jiān)控有著十分重要的意義[21]。

隨著人們對體內(nèi)抗體親和力成熟的深入研究，體外抗體親和力成熟研究已經(jīng)成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。由于抗體的成分絕大部分為蛋白質(zhì)，因此體外抗體親和力成熟可歸屬于體外功能蛋白質(zhì)分子進(jìn)化的范疇。體外抗體親和力成熟一般可以采用隨機(jī)突變編碼可變區(qū)的基因片段的方法和定向引入突變(site-directed mutagenesis)的方法及近來研究比較熱門的基于抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)調(diào)整的方法。

2.1隨機(jī)突變法

采用隨機(jī)突變編碼可變區(qū)的基因片段的方法一般又有錯(cuò)配PCR法(error-prone PCR)、DNA改組法(DNA shuffling)和鏈置換法(chain shuffling)等。錯(cuò)配PCR法通過改變PCR 的條件，使目的基因片段在復(fù)制的過程中堿基對發(fā)生錯(cuò)誤的配對，從而引入突變。Finlay等[22]以隨機(jī)突變?yōu)榛A(chǔ)，聯(lián)合運(yùn)用錯(cuò)誤傾向PCR、DNA 重組等方法，使親和力提高了110倍。DNA 改組法同樣運(yùn)用隨機(jī)突變的原理，在獲得較大容量的功能蛋白質(zhì)突變體庫的基礎(chǔ)上，結(jié)合運(yùn)用相應(yīng)的快速富集篩選方法(主要是以噬菌體表面展示為主的各種表面展示技術(shù)) 對突變體進(jìn)行篩選，最終得到進(jìn)化的功能蛋白質(zhì)分子。Kim等[23]結(jié)合噬菌體庫展示技術(shù)通過DNA 改組把抗體親和力提高了9倍。鏈置換則依據(jù)抗體可變區(qū)隨機(jī)配對的原理，在抗體的一條鏈保持不變的情況下，將另一條鏈進(jìn)行替換，之后從中篩選出高親和力的抗體分子。Hur等[24]運(yùn)用鏈置換技術(shù)成功將一個(gè)天然抗體的親和力提高了36倍，同時(shí)獲得了抗體片段在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)?？傮w來看，采用隨機(jī)突變編碼可變區(qū)的基因片段的方法，隨著研究人員的不斷改進(jìn)，該技術(shù)有了長足的發(fā)展，但是此方法始終有著盲目和隨機(jī)性的缺點(diǎn)，使得在相關(guān)的研究中對突變的結(jié)果較難把握。

2.2定向突變方法

采用定向引入突變的方法的前提是對基因及表達(dá)的蛋白產(chǎn)物的三維結(jié)構(gòu)和功能等方面的信息有著較為透徹的了解。研究表明，抗體的互補(bǔ)決定區(qū)集中在一起形成一個(gè)特定的三維結(jié)構(gòu)，其中包含了一個(gè)和抗原結(jié)合的部位，同時(shí)互補(bǔ)決定區(qū)突變的頻率也最為頻繁，通過對抗原抗體結(jié)合部位的晶體結(jié)構(gòu)的分析，在一定程度上可提示出哪些特定部位的氨基酸殘基可以優(yōu)先突變來提高親和力。近年來，借助計(jì)算機(jī)軟件同源模建技術(shù)，在模擬抗原抗體結(jié)合過程中的構(gòu)象及能態(tài)的變化的基礎(chǔ)上有針對性地對互補(bǔ)決定區(qū)的基因進(jìn)行突變，已成為一個(gè)研究的熱點(diǎn)。Akikazu等[25]通過對一株抗乙酰膽堿Fab重鏈95位上的酪氨酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，替換成為甘氨酸之后，突變體親和力提高了100倍。對于如何選取針對性的突變點(diǎn)，丙氨酸掃描法(alanine scanning)具有一定的優(yōu)勢。丙氨酸掃描突變采用體外定向突變的策略，通過改變密碼子的序列，系統(tǒng)地將丙氨酸置換特殊的氨基酸，然后通過測定抗原抗體解離速率是否下降來確定可進(jìn)一步優(yōu)化的氨基酸(optimized residue substitution，ORS)，同時(shí)對它們進(jìn)行隨機(jī)的突變，可篩選得到解離速率最低的氨基酸，最后僅通過選定氨基酸的置換來提高抗體親和力[26，27]。此方法目的明確，繞開了不好選擇突變頻率的難題，同時(shí)避免了隨機(jī)突變編碼可變區(qū)基因片段法隨意性大的缺點(diǎn)。

2.3基于抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)調(diào)整的方法

通過對抗體親和力成熟的深入研究，已發(fā)現(xiàn)抗原結(jié)合位點(diǎn)處的氨基酸對抗體親和力具有顯著的作用。Li等[28]首次運(yùn)用X射線晶體衍射技術(shù)，通過研究抗原-抗體結(jié)合的三維構(gòu)象來研究抗體親和力成熟的過程，研究表明，抗原和抗體的結(jié)合面積的加大在抗體親和力成熟過程中并不出現(xiàn)，而可能是抗原結(jié)合位點(diǎn)周圍的一些氨基酸殘基的變化增加了疏水性作用力，從而使抗原和抗體的結(jié)合更加緊密，互補(bǔ)性增強(qiáng)。Cauerhff等[29]的研究也表明，抗體親和力成熟更重要的可能是一些小結(jié)構(gòu)的變化，尤其是分布在抗原結(jié)合部位周圍一些位點(diǎn)，而這些小的變化使得抗體和抗原結(jié)合部位從構(gòu)象上來說更加契合抗原的三維結(jié)構(gòu)，兩者互補(bǔ)性更趨完善。Yau等[30]也發(fā)現(xiàn)熱點(diǎn)突變對親和力提高可能是通過突變使得可變區(qū)的可溶性和結(jié)構(gòu)方面的物理特性產(chǎn)生了積極的影響，這意味著如果能夠充分了解抗體親和力成熟的過程中真實(shí)的結(jié)構(gòu)水平和能量轉(zhuǎn)化上的改變，就能理性地提出對抗體親和力體外成熟的可控策略。近年來，借助計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)，通過同源模建獲取抗體模型，并分析抗原抗體結(jié)合活性位點(diǎn)，探究抗原與抗體之間的相互作用，并對抗體的氨基酸序列進(jìn)行修改，提高抗體親和力，已經(jīng)成為一種重要的手段[31～35]。

3 展望

分子模擬和計(jì)算機(jī)輔助抗體進(jìn)化是當(dāng)前計(jì)算機(jī)科學(xué)與生物學(xué)相結(jié)合研究的重要體現(xiàn)，目前該技術(shù)運(yùn)用主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是用分子動(dòng)力學(xué)模擬方法對抗體進(jìn)行動(dòng)態(tài)的模擬，借助計(jì)算機(jī)理論模型和數(shù)據(jù)庫分析，直接從抗體的氨基酸序列預(yù)測抗體三維結(jié)構(gòu)以及動(dòng)力學(xué)特征，通過計(jì)算模擬抗原和抗體間的分子識(shí)別，了解抗體結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；二是通過分子模擬技術(shù)充分計(jì)算抗原抗體在結(jié)合過程中的能量變化，找出二者結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)及重要的能量變化過程，借助抗體數(shù)據(jù)庫，通過對關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸的調(diào)整，篩選出更加合理的抗體構(gòu)象，增強(qiáng)抗體的某種屬性[36～38]。

抗體作為醫(yī)藥、食品安全領(lǐng)域等研究領(lǐng)域重要的“原材料”，其重要性不言而喻。但是，基因工程抗體的廣泛應(yīng)用卻受限于其抗原結(jié)合能力不強(qiáng)的問題。值得慶幸的是，基因工程抗體容易在分子和基因水平上進(jìn)行修飾和改造，這為體外進(jìn)行抗體親和力成熟提供了可能。另外體外提高抗體親和力的方法實(shí)際上都是模仿體內(nèi)抗體的成熟過程，隨著分子模擬技術(shù)的發(fā)展，利用分子對接等手段針對基因工程抗體的序列進(jìn)行改造將為抗體定向進(jìn)化提供廣闊的應(yīng)用前景[39～42]。

通過分子模擬技術(shù)對基因工程抗體進(jìn)行改造僅僅是分子模擬技術(shù)運(yùn)用的一個(gè)體現(xiàn)，作為交叉學(xué)科的一項(xiàng)重要的技術(shù)，分子模擬技術(shù)在生物學(xué)、物理學(xué)及材料學(xué)等交叉領(lǐng)域的發(fā)展仍舊需要我們進(jìn)一步研究和探索[43]。

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