李夢嬌, 彭 晟, 徐紹忠, 余代宏, 趙明富*, 文國松*

1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 昆明 650021;

2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省中藥材規(guī)范化種植技術(shù)指導(dǎo)中心, 昆明 650021;

3.元江縣農(nóng)科所, 云南 玉溪 653300

克雷伯氏菌屬(Klebsiellaspp.)的一些種類是重要的條件致病菌和醫(yī)源性感染菌，其中以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)對人致病性最強(qiáng)，但在農(nóng)業(yè)微生物和工業(yè)污染治理等方面的研究表明，克雷伯氏菌對植物本身不表現(xiàn)致病性，而且還是一種綠色菌肥和高效凈化劑?？死撞暇毡榉植加诤瘫究浦仓甑母恳约巴寥乐?，是一種豐富的根系聯(lián)合固氮微生物資源，與植物在長期進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育過程中建立起緊密的合作關(guān)系，對植物的生長及代謝起著間接的促進(jìn)作用。關(guān)于克雷伯菌的研究已有很多報道，研究主要涉及克雷伯氏菌菌株促進(jìn)土壤營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化、降解苯類有機(jī)物、作為鐵載體等方面。本文將克雷伯氏菌主要種類的特性以及在農(nóng)業(yè)和環(huán)境治理的應(yīng)用研究進(jìn)展作一概述。

1 克雷伯氏菌的主要種類及特性

克雷伯氏菌屬菌體形態(tài)為桿狀，大小約(0.3～1.0)μm×(0.6～6.0)μm。單個、成對或短鏈狀排列。無芽胞，無鞭毛，有莢膜，革蘭氏染色反應(yīng)為陰性，氧化酶陰性。兼性厭氧型，對營養(yǎng)要求不高，不需要特殊的生長因子。在固體培養(yǎng)基上可形成特征性的粘液狀菌落，表現(xiàn)為接種環(huán)不易挑起，易拉成絲，有助鑒別。在腸道桿菌選擇性培養(yǎng)基上能發(fā)酵乳糖，呈現(xiàn)有色菌落。發(fā)酵糖類活潑，并且產(chǎn)酸產(chǎn)氣。該屬細(xì)菌55℃下30 min可被滅活。在固體培養(yǎng)基上可存活數(shù)周至數(shù)月?？死撞暇鷮侔ǚ窝卓死撞暇?Klebsiellapeneumoniae)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、解鳥氨酸克雷伯氏菌(Klebsiellaornithinolytica)、土生克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)、植生克雷伯氏菌(Klebsiellaplanticola)、臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiellaozaenae)、臭硬結(jié)克雷伯氏菌(Klebsiellarhinoscleromatis)和變棲克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)。臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiellaozaenae)、臭硬結(jié)克雷伯氏菌(Klebsiellarhinoscleromatis)也作為肺炎克雷伯氏菌的亞種，稱為肺炎克雷伯菌臭鼻克雷伯氏菌和鼻硬結(jié)克雷伯氏菌亞種。在以上克雷伯氏菌中，與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)密切相關(guān)的有肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、土生克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌以及最近幾年報道的變棲克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)。各菌主要生理生化特征見表1。

表1 克雷伯氏菌菌各菌種生理生化特征

2 克雷伯氏菌在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用

克雷伯氏菌在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用比較廣泛，主要有固氮、作物增產(chǎn)、增強(qiáng)植物溶磷能力、促生長等作用，并且產(chǎn)生相關(guān)作用的菌株可發(fā)酵成綠色菌肥用于實(shí)際生產(chǎn)。

2.1克雷伯氏菌的固氮作用

克雷伯氏菌具有固氮功能，對植物有促生長作用。李鳳汀等[1]利用15N稀釋法研究小麥接種肺炎克雷伯氏菌(K.pneuniae)的聯(lián)合固氮作用。結(jié)果表明，小麥根系存在固氮有機(jī)體，直接為植株提供的氮素占其總氮量的l5.3％～22.1％，干物質(zhì)重和15N含量與對照相比差異顯著。李樹品等[2]和黃磊等[3]從小麥根系分離得到固氮酶活性較高的TB-3、CXK192和CXK193菌株，經(jīng)鑒定均屬克雷伯氏菌。韓梅等[4]從玉米東單90和鄭單958健康鮮植株中均分離到克雷伯氏菌(Klebsiellatrevisan)，利用乙炔還原法測定出固氮酶活性，通過對玉米的促生長作用作進(jìn)一步研究，結(jié)果表明該菌為內(nèi)生固氮菌，對幼苗期玉米具有顯著的促生長作用。羅霆等[5]采用無氮Dobereiner培養(yǎng)基，從甘蔗品種桂糖28號的根系中分離篩選到1株高固氮活性的細(xì)菌菌株L03，形態(tài)、生理生化、16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定L03為植生克雷伯氏菌(K.plantien)，該菌固氮百分率達(dá)29％，并在連續(xù)繼代培養(yǎng)13次后仍保持固氮能力不變。李樹品等[2]將產(chǎn)酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)菌懸液與草炭土按一定比例充分混勻，在砂培試驗(yàn)中，用于小麥種子拌種，結(jié)果拌菌劑的小麥生長速度快，略有提早出苗，植株較健壯并且干重增加，從而顯示該菌劑對小麥具有明顯的促生效果。而李鳳汀等[1]將肺炎克雷伯氏菌接種到小麥植株上，同樣獲得了小麥增產(chǎn)的效果，即小麥總莖數(shù)、綠色葉片數(shù)與對照相比明顯增加，干物質(zhì)累積也增多，測定的固氮酶活性也比對照高十幾倍。

從克雷伯氏菌屬細(xì)菌中克隆到固氮基因nif已有報道[6～9]，證實(shí)了克雷伯氏菌屬細(xì)菌具有固氮作用的遺傳基礎(chǔ)，并且在禾本科植物的聯(lián)合固氮上發(fā)揮重要作用。在肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae)中存在著17～18個nif基因，這些基因都位于其染色體上，其中有固氮酶結(jié)構(gòu)基因nifKDH、調(diào)節(jié)基因nifAL和固氮酶合成后的加工基因nifB以及其他與電子傳遞相關(guān)的基因。所有nif基因均連鎖在一起，其中不存在非nif基因的插入成分；在nif基因群中存在著7個操縱子，其中有6個操縱子具有向同一方向進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的功能；在nifF基因和nifH基因之間還存在著一段反向閱讀框架。

2.2克雷伯氏菌的溶磷、解鉀作用

土生克雷伯氏菌(K.pneumonia)能夠提高植株的生物量與植物體的含磷量，并且該菌能順利入侵禾本科植物的根內(nèi)并成功定殖[10]。微生物解磷作用依賴于微生物分泌有機(jī)酸的能力，這些酸既能降低pH，又能夠與鈣、鐵、鋁等離子結(jié)合，從而使難溶性磷酸鹽溶解成可溶性鹽，易于植物吸收[11,12]。

王小妹等[13]采用固、液體無機(jī)磷培養(yǎng)基研究從土壤中分離得到土生克雷伯氏桿菌102菌株(K.pneumoniae102)，在液體純培養(yǎng)條件下，該菌在無可溶性磷存在時其溶解磷礦粉的量高達(dá)72.83 mg/L；在含有10 mg/L、20 mg/L 磷酸二氫鉀時，該菌溶解磷礦粉的量分別為61.92 mg/L、66.36 mg/L。葉小梅[10]進(jìn)而采用室內(nèi)盆栽方法，研究了菌株102在兩種土壤中對黑麥草生長、 磷吸收以及土壤有效磷的影響，同時采用抗生素與GFP雙標(biāo)記法觀察其在黑麥草根內(nèi)定殖情況。研究發(fā)現(xiàn)，接種102菌25 d后，馬肝土與潮土中的有效磷含量分別增加9.7％和42.1％，差異達(dá)到顯著水平。 接種102菌還顯著提高了黑麥草生物量與植物體磷含量，示蹤結(jié)果表明102菌能夠入侵黑麥草根內(nèi)并定殖。通過調(diào)控克雷伯氏菌的營養(yǎng)和其他環(huán)境條件，還可使產(chǎn)酸克雷伯氏菌產(chǎn)生較多的IAA為植物提供更多的外源促生長物質(zhì)，促進(jìn)植物的生長發(fā)育，特別是根系的生長[14]。

此外，張成省等[15]利用選擇性培養(yǎng)基從煙草根際篩選到27株解鉀細(xì)菌，測定解鉀細(xì)菌的解鉀效能并研究其對煙草的促生作用。27株菌株的16S rDNA序列分析結(jié)果表明，這些煙草根際土壤解鉀細(xì)菌中克雷伯菌屬(Klebsiellaspp.)為優(yōu)勢菌屬，占66.67％。

2.3克雷伯氏菌的生物防治作用

隨著對人類健康和環(huán)境問題的關(guān)注，根際細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物的應(yīng)用將為促進(jìn)植物生長、防御植物病原菌提供新途徑。Park等[16]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)酸克雷伯菌(K.oxytoca)可引起系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性(induced systemic resistance，ISR)主動防御軟腐病原菌胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種[Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorumSCCI(SCC1)]，其代謝物在12 mmol/L時對SCC1引起的癥狀有顯著抑制作用。將分離得到的代謝物經(jīng)高分辨率質(zhì)譜分析表明其為C9H15O3N有機(jī)物，分子量大小為185.11?；诤舜殴舱褡V分析，分離得到的代謝物被鑒定為2-吡咯烷酮-5-羧酸丁酯(BPC)。

關(guān)于克雷伯氏菌作為生防菌應(yīng)用目前報道較少。李祖紅等[17]從石斛上分離到一株內(nèi)生細(xì)菌SH-1(Klebsiellavariicola)，用該細(xì)菌制劑防治由鏈格孢引起的煙草赤星病、甘藍(lán)黑斑病及番茄早疫病有顯著的防治效果，且該菌具有對人、畜、農(nóng)作物安全和環(huán)境友好的特點(diǎn)。另一方面，利用基因工程改造的內(nèi)生細(xì)菌來防治植物病蟲害已顯示出一定的應(yīng)用前景，如夏啟玉等[18]獲得香蕉內(nèi)生克雷伯氏菌KKWB-5的強(qiáng)啟動子片段，來達(dá)成香蕉內(nèi)生工程菌的構(gòu)建，從而達(dá)到既可提高植物的抗病蟲能力，又不會改變植物自身基因，所以該方法與轉(zhuǎn)基因植物的方法相比具有更多的優(yōu)勢。

2.4克雷伯氏菌作為鐵載體的應(yīng)用

植物根圍促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)具有固氮功能，且可產(chǎn)生和分泌嗜鐵素及各種對鐵具有高親和力的載體，合成生長素、乙烯、細(xì)胞分裂素和維生素等不同植物激素，溶解礦物質(zhì)等[19～21]。何苗等[22，23]通過鉻天青(chrome azural S，CAS)檢測法篩選出一株產(chǎn)鐵載體能力較強(qiáng)的細(xì)菌菌株MX-26(K.oxytoca)，并證實(shí)該菌能夠分泌鐵載體到其細(xì)胞外或細(xì)胞表面，作為螯合因子來結(jié)合Fe3+或者將含鐵化合物變?yōu)榭扇苄问揭员闫淅谩ζ溥M(jìn)行紫外誘變(180 S)、紫外和氯化鋰(終濃度1.2％)復(fù)合誘變及紫外和硫酸二乙酯(DES)復(fù)合誘變(40 min)，誘變獲得的菌株的產(chǎn)鐵載體能力較出發(fā)菌株提高了32.9％，且遺傳性能較穩(wěn)定，并能成功定殖在土壤中，這對防治石灰性土壤上植物的缺鐵黃化有重要意義。該研究還發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行單一紫外誘變獲得的誘變菌株很容易失去誘變獲得的性能，而紫外和氯化鋰或者硫酸二乙酯復(fù)合誘變所獲得的突變株其遺傳穩(wěn)定性明確高于單純的紫外誘變，其中，作為誘變輔助劑的氯化鋰和硫酸二乙酯起到了非常重要的作用。

3 克雷伯氏菌在環(huán)境污染物降解方面的研究

克雷伯氏菌比厭氧菌生長更快，通常能把復(fù)雜有機(jī)化合物降解為無機(jī)物，能比較有效地降低化合物的毒性[24]，從而在降解農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染治理方面也具有一定的應(yīng)用前景。

氯氰菊酯是茶葉生產(chǎn)上使用比較廣泛的高效殺蟲劑，其自然條件下很難快速降解, 并且長期使用會導(dǎo)致茶葉的農(nóng)藥殘留超標(biāo)和環(huán)境污染[25，26]。米蘭等[27]從茶園土壤中分離到1株產(chǎn)酸克雷伯氏菌, 研究證實(shí)該菌株對氯氰菊酯的耐受性、降解性及穩(wěn)定性均較好。因此，可挖掘克雷伯氏菌的農(nóng)藥降解酶基因，構(gòu)建工程菌株。王卓婭等[28]通過構(gòu)建基因文庫的方式，使一株克雷伯氏菌(Klebsiellaspp.)獲得了新的菊酯農(nóng)藥降解酶(EstP)基因，并借助生物信息學(xué)技術(shù)優(yōu)化該基因的表達(dá)，以構(gòu)建降解能力更強(qiáng)的工程菌。

克雷伯氏菌在處理工業(yè)廢水方面的研究也很多，如已經(jīng)證實(shí)從含氰廢水中分離出來的克雷伯氏菌通過生物降解能將氰化物轉(zhuǎn)變無毒的產(chǎn)物[29]，對采用生物處理含氰廢水具有著較大的研究意義。王強(qiáng)等[24]在活性污泥中分離出一株產(chǎn)酸克雷伯氏菌，研究發(fā)現(xiàn)該菌株具有降解苯酚的能力。邊俠玲等[30]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)KlebsiellaZY-B能以雙酚A為唯一碳源生長，適宜的發(fā)酵溫度為30～35℃，在中性介質(zhì)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解能力，具有較大的工業(yè)應(yīng)用價值。趙迪[31]從硝基苯污水處理池中篩選分離得到一株能利用硝基苯為唯一碳源且將其高效降解的菌株，命名為NB-K，16S rDNA序列分析顯示其與Klebsiellavariicola的16S rDNA序列相似度達(dá)99％。在治理工業(yè)廢氣污染方面，趙翠翠等[32]對克雷伯氏菌ME17菌株進(jìn)行了優(yōu)化條件和初始培養(yǎng)條件的比較，在pH 6.0，24.4℃的培養(yǎng)條件下，采用接種量6.7％，ME17對25％CH4的脫除能力較高，因而該菌株具有治理煤礦和垃圾填埋釋放CH4的應(yīng)用潛力。

克雷伯氏菌對環(huán)境污染物的降解機(jī)制研究有助于提高降解酶的降解能力。葉錦韶等[33]研究肺炎克雷伯氏菌對三苯基錫(TPhT)的酶促降解特性時發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯氏菌的胞內(nèi)降解酶對TPhT的降解率最高，并且pH、溫度、TPhT濃度和金屬離子等環(huán)境因素均會對胞內(nèi)酶降解TPhT的效果產(chǎn)生影響，其中Mg2+的作用最明顯，能有效地提高TPhT酶促降解的效果，當(dāng)Mg2+的添加濃度為15 mg/L 時，胞內(nèi)酶對TPhT的降解率高達(dá)73.8％。

4 展望

克雷伯氏菌屬細(xì)菌具有明顯的高效固氮、促生長作用、對植物病害的生防作用以及環(huán)境污染物降解作用，屬有益菌。更好地挖掘該菌屬的生物功能并加以利用還需要在以下方面進(jìn)行探討。

在植物營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化研究方面，盡管有研究證明肺炎克雷伯氏菌能夠提高植物的固氮水平，但由于其致病性，并不宜作為菌劑使用，其研究應(yīng)更傾向于固氮機(jī)理的研究，為工程菌劑的開發(fā)提供基礎(chǔ)。在大田生產(chǎn)中，大量的施用氮肥可能是使固氮菌失活的最主要原因[5]，因此高固氮農(nóng)作物品種選育應(yīng)與增加大田或作物體內(nèi)的固氮菌種類和數(shù)量結(jié)合起來，并在此基礎(chǔ)上發(fā)揮其固氮特性。但篩選出適合本地區(qū)栽培品種的高效內(nèi)生固氮菌有一定的難度，因?yàn)閮?nèi)生固氮菌對作物的內(nèi)外部環(huán)境的適應(yīng)性是特異的，不同的作物品種、溫濕度和光強(qiáng)會影響其與宿主的聯(lián)合固氮能力[34]，所以需在大田中做大量的接種或回接實(shí)驗(yàn)，以確定某種固氮菌是否適合當(dāng)?shù)卮筇锏穆?lián)合固氮。王小妹等[13]利用溶磷菌提高土壤磷利用效率，研究發(fā)現(xiàn)解磷菌的溶磷作用只是在中、低肥力土壤上進(jìn)行，對高肥力的土壤而言磷的利用率并沒有得到提高；溶磷菌入侵植株體內(nèi)的能力是否對土壤溶磷有幫助，還有待深入研究[10]。關(guān)于內(nèi)生工程菌的構(gòu)建，雖然已構(gòu)建出內(nèi)生克雷伯氏菌的工程菌[18]，但該類菌在農(nóng)作物或水果作物上的定殖還沒有報道，可以對工程菌的定殖能力、生防特性的遺傳穩(wěn)定性等方面進(jìn)行研究。

在農(nóng)藥殘留降解方面，克雷伯氏菌也是一種潛力巨大的生態(tài)菌，如對菊酯類農(nóng)藥的降解。深入了解菊酯降解酶的作用機(jī)制，構(gòu)建高效工程菌有助于開發(fā)菊酯農(nóng)藥殘留降解制劑，在突破綠色壁壘、保護(hù)生態(tài)環(huán)境及維護(hù)人類生存環(huán)境安全等方面具有很大的應(yīng)用價值。

充分發(fā)揮克雷伯氏菌在農(nóng)業(yè)發(fā)展、環(huán)境治理、工業(yè)生產(chǎn)等方面的應(yīng)用潛力，還需要進(jìn)一步開展該菌作用機(jī)理方面的研究，深入解析其作用的分子機(jī)制，并對其代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行系統(tǒng)性研究，同時，加強(qiáng)與植物栽培育種、植物生理以及生態(tài)環(huán)境等學(xué)科的交叉研究。

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