施建春,楊惠萍

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106;2.國家家禽工程技術(shù)研究中心,上海 201106)

不同佐劑的新城疫疫苗免疫效果的研究

施建春1,2,楊惠萍1,2

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106;2.國家家禽工程技術(shù)研究中心,上海 201106)

為評價不同佐劑的新城疫(newcastle disease，ND)滅活疫苗對雞的免疫效果，選用鋁膠佐劑、國產(chǎn)油佐劑及進口油佐劑與新城疫病毒抗原混合制成疫苗，免疫雛雞，探討不同佐劑的疫苗對雞的安全性、新城疫的HI抗體水平及攻毒保護率。結(jié)果表明，3種佐劑的疫苗注射部位無不良反應(yīng)；28天時HI抗體分別為28.2、28.5和28.8；56天時HI抗體分別為27.4、28.8和29.2，攻毒后的保護率分別為90%、100%和100%，鋁膠佐劑、國產(chǎn)油佐劑、進口油佐劑配制的新城疫滅活疫苗以及對照組攻毒后肛棉拭子NDV陽性率分別為10%、0、0及100%。用進口油佐劑配制的疫苗可刺激接種動物產(chǎn)生快速免疫應(yīng)答反應(yīng)，抗體產(chǎn)生的效價高、維持的時間長，其效果優(yōu)于其它佐劑，有望成為ND滅活疫苗的候選佐劑。

佐劑；新城疫病毒；ND的HI抗體；攻毒保護率

新城疫(newcastle disease，ND)是危害養(yǎng)雞業(yè)的主要傳染病之一,是由新城疫病毒引起的一種主要侵害雞的急性高度接觸傳染性疾病。其主要臨床癥狀是呼吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂、黏膜和漿膜出血[1]。新城疫發(fā)病率和死亡率都很高，疫苗免疫是防治ND暴發(fā)和避免造成重大損失的主要預(yù)防措施。雞新城疫疫苗分為兩大類，一類為滅活疫苗，另一類為減毒活疫苗。其中，滅活疫苗進一步分單純滅活疫苗和油乳劑滅活疫苗，目前應(yīng)用較廣泛的是油乳劑滅活疫苗。雞新城疫滅活疫苗主要是由滅活劑滅活雞新城疫病毒液后的半成品與佐劑以適當(dāng)?shù)谋壤旌吓渲贫伞Ｔ缭?925年，Ramon發(fā)現(xiàn)一些與抗原無關(guān)的物質(zhì)如金屬鹽、皂角甘等可增強類毒素或白喉毒素的免疫效果，免疫佐劑便被廣泛地應(yīng)用于疫苗的生產(chǎn)和研究中[2]。佐劑可非特異性地通過物理或化學(xué)的方式與特異性抗原結(jié)合，從而誘導(dǎo)機體免疫系統(tǒng)(體液或細胞免疫系統(tǒng))產(chǎn)生對抗原或免疫原的免疫應(yīng)答反應(yīng)，包括增強免疫反應(yīng)強度和反應(yīng)的持久性[3]。常用的佐劑有鋁鹽佐劑、礦物油佐劑、表面活性劑類佐劑、天然來源及中草藥佐劑、細胞因子佐劑以及納米佐劑等。為了篩選一種免疫效果好、副反應(yīng)小的佐劑作為新城疫疫苗的佐劑，選擇進口的油佐劑、國產(chǎn)的油佐劑及氫氧化鋁佐劑配制雞新城疫滅活疫苗，進行免疫效果的比較試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株

新城疫病毒分離株及標(biāo)準(zhǔn)毒株由本實驗室保存，血凝價大于10log2。

1.1.2 雞胚及其它

SPF種蛋購自北京梅里亞維通實驗動物有限公司；鋁膠佐劑由上海海利生物制品公司贈送，進口油佐劑為法國SEPPIC公司生產(chǎn)的產(chǎn)品，國產(chǎn)油佐劑為杭州杭州煉油廠生產(chǎn)的獸用白油。司班-80、吐溫-80和硬脂酸鋁均購自天津天大化工廠。

1.1.3 主要器材

96孔V型微量血凝板，TDL-5離心機，QL-861微量渦旋混勻機，BCD-216YH冰箱，DH5000AB溫箱，20～200 μL及100～1000 μL移液器等。制備疫苗乳化設(shè)備：膠體磨。

1.1.4 實驗動物

SPF種蛋購自北京梅里亞維通實驗動物有限公司，在本實驗室孵化并在上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動物房隔離飼養(yǎng)至30日齡。飼養(yǎng)期間不進行任何疫苗接種。

1.1.5 1%雞紅細胞懸液配制

配制濃度為0.85%的生理鹽水，121℃高壓滅菌30 min。SPF雞翅下靜脈采血，與等量阿氏液混合，離心，洗滌再離心，配制1%雞紅細胞懸液[4]。

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1.2 方法

1.2.1 病毒液制備

選取10 日齡健康雞胚，將經(jīng)無菌檢驗、外源病毒檢驗及毒價測定合格的新城疫種毒進行適當(dāng)稀釋后接種，每胚接種0.2 mL，放入后孵化室中。孵化溫度37℃，濕度70%，培養(yǎng)72 h。期間照蛋每天2次，將24 h死亡的雞胚取出廢棄。收集24～72 h死亡雞胚，2～8℃冷卻，收集尿囊液，進行血凝試驗，選取血凝價在7log2以上的尿囊液用于制備抗原。

1.2.2 病毒液的滅活及滅活檢驗

將制備的病毒液加0.20%的甲醛后搖勻置37℃、180 r·min-1搖床中滅活48 h。取小樣接種6個10日齡健康雞胚，0.2 mL·胚-1，放入37℃的孵化室中孵化。觀察5日，之后收集尿囊液，進行血凝試驗。

1.2.3 疫苗的制備

將前述滅活后的新城疫病毒分離毒與鋁膠佐劑以1∶1的比例混合后充分搖勻，制成鋁膠滅活苗。加入防腐劑硫柳汞，使最終濃度為0.01/%。

1.2.3.2 進口油佐劑滅活疫苗的制備

將前述滅活的ND病毒液與進口佐劑以1∶1的比例進行乳化即配制成新城疫油乳劑滅活苗。加入防腐劑硫柳汞，使最終濃度為0.01/%。

1.2.3.3 國產(chǎn)油佐劑滅活疫苗的制備

將前述滅活的病毒液與國產(chǎn)佐劑以6∶4的比例進行乳化即配制成新城疫油乳劑滅活苗。加入防腐劑硫柳汞，使最終濃度為0.01/%。

1.2.4 無菌檢驗

按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行無菌檢驗[5]。

1.2.5 不同佐劑疫苗的安全性檢驗

用30日齡SPF雞35只，隨機分為4組，其中3組為免疫組，每組10只，分別肌肉注射鋁膠佐劑、國產(chǎn)油佐劑、進口油佐劑的新城疫滅活疫苗，每只1 mL(2羽份)；5只作為對照組不免疫，連續(xù)觀察14日，觀察注射部位及雞全身的不良反應(yīng) 。

1.2.6 不同佐劑疫苗的效力試驗

1.2.6.1 血清學(xué)試驗

用30日齡SPF雞35只，共分4組其中3組為免疫組，每組10只，分別肌肉注射鋁膠佐劑、國產(chǎn)油佐劑、進口油佐劑的新城疫滅活疫苗每只0.2 mL(1/2.5羽份)；5只作為對照組不免疫。接種28日、56日后，每只雞分別采血，分離血清，按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行HI抗體效價測定[5]。

1.2.6.2 免疫攻毒試驗

用30日齡SPF雞40只，共分5組,其中3組為免疫組，每組10只，分別肌肉注射鋁膠佐劑、國產(chǎn)油佐劑、進口油佐劑的新城疫滅活疫苗每只0.2 mL，第4組5只作為攻毒對照組不免疫，隨免疫組一起攻毒；第5組5只作為對照組不免疫，不攻毒，接種后56日，每只雞分別肌肉注射新城疫病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株，106.0LED50[6]；觀察14 d，記錄雞的死亡數(shù)。

1.2.6.3 病毒分離

攻毒后第5天采集泄殖腔糞便，無菌處理后接種10日齡雞胚并進行病毒分離。

2 結(jié)果

2.1 半成品的滅活檢驗

取小樣接種6個10日齡健康雞胚，觀察5 d無死亡雞胚，收胚后進行ND的HA檢測，均無血凝性。

2.2 無菌檢驗

將3種疫苗分別接種TG小瓶(規(guī)格：50 mL)，1.0 mL·瓶-1，置 37℃培養(yǎng)，3 d后吸取培養(yǎng)物，分別接種TG小管、GA斜面管各2支和GP小管1支，0.2 mL·支-1，一支TG、GA置37℃，一支TG、GA、GP置 25℃，培養(yǎng)5 d，均無菌生長。

2.3 疫苗的安全性檢驗

用12日齡SPF雞35只，每只肌肉注射疫苗1 mL，連續(xù)觀察14 d。3個免疫組和對照組均注射部位無不良反應(yīng)，所有雞群食欲及精神狀態(tài)良好，解剖免疫組雞內(nèi)臟均無病理變化，見表1。

表1 不同ND疫苗的安全性試驗

2.4 疫苗的效力試驗

2.4.1 血清學(xué)試驗

肌肉注射鋁膠佐劑、國產(chǎn)油佐劑、進口油佐劑配制的新城疫滅活疫苗0.2 mL·只-1。接種后28日， HI抗體效價3組分別為28.2、28.5、28.8，接種后56日， HI抗體效價3組分別為27.4、28.8、29.2，見表2。統(tǒng)計學(xué)分析28日時,鋁膠佐劑與國產(chǎn)油佐劑，鋁膠佐劑與進口油佐劑，國產(chǎn)油佐劑與進口油佐劑之間的P值分別為0.104、0.025、0.193，所以國產(chǎn)油佐劑分別與進口油佐劑和鋁膠佐劑組之間差異不顯著，但進口油佐劑與鋁膠佐劑組之間差異顯著；56日時,鋁膠佐劑與國產(chǎn)油佐劑，鋁膠佐劑與進口油佐劑，國產(chǎn)油佐劑與進口油佐劑之間的P值分別為0.001、0.0002、0.343，鋁膠佐劑分別與國產(chǎn)油佐劑和進口油佐劑組之間差異極顯著，但進口油佐劑與進口油佐劑組之間差異不顯著。

表2 3種ND滅活疫苗的HI抗體檢測結(jié)果

2.4.2 免疫攻毒試驗

肌肉注射鋁膠佐劑、國產(chǎn)油佐劑、進口油佐劑配制的新城疫滅活疫苗0.2 mL·只-1。接種后56日進行攻毒，3組的保護率分別為90%、100%、100%。具體結(jié)果見表3。

表3 不同疫苗的攻毒保護率試驗

2.5 病毒分離

攻毒后第5天用棉拭子采集泄殖腔糞便，并進行病毒分離，對照組陽性率100%，鋁膠佐劑、國產(chǎn)油佐劑、進口油佐劑配制的新城疫滅活疫苗攻毒后病毒分離的陽性率分別為10%、0和0。

3 討論與結(jié)論

免疫佐劑是生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑中的免疫調(diào)節(jié)劑，非特異性免疫刺激作用是使機體產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答所必需的基本條件，如果這種作用過度或過強，必然會出現(xiàn)毒副作用[7]。因此，在佐劑選擇時應(yīng)選擇不僅可引起適當(dāng)?shù)拿庖叽龠M作用且具有安全性的佐劑，與抗原在配比時用適當(dāng)?shù)谋壤渲苼泶_保疫苗的應(yīng)有粘度及穩(wěn)定性等。

取滅活后的病毒液接種健康雞胚，無死亡雞胚，收胚后進行ND的HA檢測，均無血凝性，說明ND病毒液滅活較徹底，配苗用的半成品是安全的。

礦物油佐劑應(yīng)用最為普遍，在動物實驗中大量使用，其免疫耐受性極好，且抗體滴度能夠維持兩個月，效果優(yōu)于鋁佐劑[8]。鋁佐劑是目前獸用疫苗和人用疫苗中應(yīng)用最廣泛的佐劑，也是疫苗研究中常用的佐劑，所以在本次試驗中選擇鋁膠佐劑、國產(chǎn)油佐劑、進口油佐劑進行免疫接種。免疫接種3種疫苗后均無腫塊及不良反應(yīng)，說明3種佐劑的生物降解性強，佐劑釋放和存儲比較穩(wěn)定，無毒副作用。

鋁膠佐劑、國產(chǎn)油佐劑、進口油佐劑配制的新城疫滅活疫苗免疫28 d后HI抗體水平分別為28.2、28.5、28.8，56 d后HI抗體水平分別為27.4、28.8、29.2，進口油佐劑配制的新城疫滅活疫苗抗體水平最高，鋁膠佐劑配制的新城疫滅活疫苗抗體水平最低，56天時油佐劑配制的新城疫滅活疫苗抗體水平在升高而鋁膠佐劑配制的新城疫滅活疫苗抗體水平開始降低；28日時進口油佐劑和鋁膠佐劑組之間差異顯著；56日時鋁膠佐劑與國產(chǎn)油佐劑、進口油佐劑組差異顯著。56天攻毒后鋁膠佐劑、國產(chǎn)油佐劑、進口油佐劑配制的新城疫滅活疫苗的保護率分別為90%、100%、100%，病毒分離的陽性率分別為10%、0、0。綜上所述，佐劑應(yīng)選用進口的油佐劑。隨著人們對抗原成分的了解和免疫機理的認識，對佐劑的研究也將具有目標(biāo)性。未來的佐劑正朝著多元化的方向發(fā)展，新型佐劑的出現(xiàn)對疫苗研究和制備提供了更多的選擇性[9]。

[1]蔡寶祥．家畜傳染病學(xué)[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1980：352．

[2]鄺良德，任永軍，鄭潔,等．免疫佐劑研究概述[C]．四川省畜牧獸醫(yī)學(xué)會2010年學(xué)術(shù)年會,2010:379-381．

[3]夏芳，羅滿林，郭林,等．免疫佐劑的研究進展[J]．畜牧與飼料科學(xué)，2009，30(10)：150-152．

[4]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部．獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[S]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：321．

[5]國家藥典委員會．中華人民共和國獸藥典[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：21．

[6]中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所農(nóng)業(yè)部獸藥評審中心．獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)匯編[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011：10．

[7]高澤乾，孫建男，武煒，等．獸用免疫佐劑的研究進展[J].唐山師范學(xué)院學(xué)報，2012，34(2)：45-51．

[8]Du C，Nilsson S，Lu H，et al．Immunogenicity of the Plasmodium falciparum Pf332-DBL Domain in combination with different adjuvants[J]．Vaccine，2010，28(31)：4977-4983．

[9]李宏勝，羅金印，王旭榮,等．不同佐劑的奶牛乳房炎多聯(lián)苗對小鼠免疫機能的影響研究[J]．中國畜牧獸醫(yī)，2013，40(1)：149-152．

ImmuneEffectsofDifferentAdjuvantsonNewcastleDiseaseVaccines

Shi Jianchun1,2, Yang Huiping1,2

(1.AnimalHusbandryandVeterinaryResearchInstitute，ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences，Shanghai201106,China;2.NationalPoultryEngineeringResearchCenter，Shanghai201106,China)

To evaluate the immune effects of vairous adjuvant in newcastle disease vaccine for chicks．In thispaper，vaccines were made combining Newcastle disease virus(NDV) with propolis adjuvant, adjuvant with domestic-made white oil, and adjuvant with imported -made white oil, respectively. Chicken were immunized to study the influence of different adjuvant on chicken safety, HI antibody of ND, and protection of ND vaccine against the virulent NDV. The results showed that no adverse reaction was observed in the three kinds of vaccines; at 28 days, HI antibody was 28.2, 28.5, 28.8, respectively, and at 56 days, HI antibody was 27.4, 28.8, 29.2, respectively. Protection of ND vaccine against the virulent NDV was 90%, 100%, 100%.In chickens inoculated with aluminum plastic adjuvants, domestic oil adjuvants, imported oil adjuvants in newcastle disease vaccine, and in the control group，the positive rates of NDV by the anal swab in were 10%, 0, 0, and 100%，respectively. The results showed that white oil adjuvant assistant inactive vaccine stimulated early immune response and produced a continuous and high level antibody．The vaccine candidacy of ND inactivated vaccine with white oil adjuvant was proposed．

Adjuvant；Newcastle disease virus；HI antibody of ND；Protection of ND vaccine against the virulent NDV

2014-07-08

2014-09-02

施建春(1968-)，男(漢)，上海人，助理研究員，研究方向：疫苗研發(fā)。

楊慧萍，副研究員。Tel:021-62205528;E-mail:yhp@saas.sh.cn

S855.3

A

1671-8151(2014)06-0522-04

(編輯：馬榮博)