李華，胡世林，王海龍，朱志圖△

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 腫瘤科，遼寧 錦州121000；2.遼寧省北鎮(zhèn)市人民醫(yī)院 普外科，遼寧 北鎮(zhèn) 121307；3.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 普外科，遼寧 錦州121000）

轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾共載阿霉素和R g 3脂質(zhì)體靶向抑制胃癌細(xì)胞增殖

李華1，胡世林2，王海龍3，朱志圖1△

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 腫瘤科，遼寧 錦州121000；2.遼寧省北鎮(zhèn)市人民醫(yī)院 普外科，遼寧 北鎮(zhèn) 121307；3.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 普外科，遼寧 錦州121000）

目的制備轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾共載細(xì)胞毒藥物阿霉素(doxorubicin，DOX)和抗新生血管藥物人參皂甙Rg3脂質(zhì)體（TF modified doxorubicin and Rg 3 loaded liposome,TF-LP-DOX/Rg 3），研究與胃癌細(xì)胞的親和力以及對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用。方法采用后插入法制備轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾共載阿霉素和人參皂甙Rg3脂質(zhì)體（TF-LP-DOX/Rg 3）。通過(guò)定量的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)和定性共聚焦實(shí)驗(yàn)研究胃癌細(xì)胞對(duì)普通脂質(zhì)體（liposome,LP）和轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾脂質(zhì)體（TF modified liposome,TFLP）的親和力。MTT實(shí)驗(yàn)研究不同載藥脂質(zhì)體對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制能力。構(gòu)建MKN-28胃癌細(xì)胞腫瘤球模型，研究不同脂質(zhì)體對(duì)腫瘤球的穿透能力和腫瘤球生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MKN-28細(xì)胞對(duì)TF-LP的攝取效率是LP的2.9倍（P＜0.01）;MTT實(shí)驗(yàn)表明,TFLP-DOX/Rg3對(duì)MKN-28細(xì)胞的增殖抑制能力顯著強(qiáng)于其他組(P＜0.01);腫瘤球?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，TF-LP-DOX/Rg3具有良好的腫瘤球穿透作用和腫瘤球生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)論轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾共載細(xì)胞毒藥物阿霉素(DOX)和抗新生血管藥物人參皂甙Rg3脂質(zhì)體是一種潛在高效的胃癌靶向給藥系統(tǒng)。

轉(zhuǎn)鐵蛋白;阿霉素;人參皂甙Rg 3;腫瘤靶向

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，居于惡性腫瘤發(fā)病率的第3位[1]。在我國(guó)，胃癌的發(fā)病率居惡性腫瘤第2位，占惡性腫瘤死亡原因第3位[2]。目前，胃癌的治療以手術(shù)為主，聯(lián)合化療為輔。然而，以細(xì)胞毒為主的化學(xué)治療缺乏選擇性，難免產(chǎn)生許多不良反應(yīng)和毒性，病人耐受性較差。因此，具有腫瘤靶向性的藥物干預(yù)載體成為了當(dāng)前抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，TF）受體是一種在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面都普遍存在的受體，但是其在腫瘤細(xì)胞的表面的表達(dá)是正常細(xì)胞的4～5倍[3-4]。本研究將轉(zhuǎn)鐵蛋白通過(guò)共價(jià)鍵連接到脂質(zhì)體表面，共載細(xì)胞毒化療藥物阿霉素和抗新生血管藥物Rg 3，對(duì)其胃癌細(xì)胞靶向性以及對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 資料與方法

1.1 材料 大豆磷脂（SPC，美國(guó)Avanti polar lipids）；DSPE-PEG 2000（美國(guó)Avanti polar lipids）；膽固醇（美國(guó)sigma公司，批號(hào)：WQ 21938）； DSPE-PEG 2000-MAL (美國(guó)Avanti polar lipids，批號(hào)：AS 73628)；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；阿霉素（浙江海正藥業(yè)，批號(hào)：130812）；Rg3（美國(guó)sigma公司，批號(hào)：S137821）；胎牛血清（美國(guó)GIBCO公司）。胃癌細(xì)胞（MKN-28，ATCC)。

1.2 轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾脂質(zhì)體的制備及其表征 精密稱取大豆磷脂12.50 mg，膽固醇1.06 mg，DSPE-PEG 20000.95 mg，Rg3 0.45 mg溶于氯仿中；在茄形瓶中減壓蒸餾成膜，除去有機(jī)溶劑，置于真空干燥器中過(guò)夜；使其充分干燥，加入1 mL PBS水化，探頭超聲（80 W，超聲10 s，間隔10 s，5次）得到載Rg3脂質(zhì)體。采用硫酸銨梯度法[5-6]制備載阿霉素脂質(zhì)體和共載阿霉素與Rg3脂質(zhì)體。

采用后插入法[7-8]制備轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的共載阿霉素與Rg3脂質(zhì)體。首先將轉(zhuǎn)鐵蛋白巰基化，再與商品化的DSPE-PEG 2000-MAL孵育得到轉(zhuǎn)鐵蛋白膠束，將膠束后插入已經(jīng)制備的LP-DOX/Rg3得到TF-LP-DOX/Rg 3。取適量制備得到的脂質(zhì)體樣品，用激光粒度儀測(cè)定其粒徑和電位。采用葡萄糖凝膠柱色譜法分離脂質(zhì)體與未包載的阿霉素和Rg 3，將過(guò)柱后的脂質(zhì)體采用triton-100破乳，用HPLC法在203 nm檢測(cè)Rg3含量，在254 nm檢測(cè)阿霉素含量。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將MKN-28細(xì)胞置于含有100 mg/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2，飽和濕度，溫度為37℃。待細(xì)胞匯合度為0.8～0.9時(shí)，用2.5 mg/L胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 MKN-28 細(xì)胞對(duì)TF-LP的攝取 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，37℃培養(yǎng)24 h后，每孔加入適量TF-LP-DOX和LP-DOX使孔中阿霉素的濃度為0.20 nmol/mL，37℃分別孵育2 h和4 h后除去含脂質(zhì)體培養(yǎng)基，冷PBS清洗3次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光讀數(shù)。

為了定性觀察MKN-28細(xì)胞對(duì)不同脂質(zhì)體的攝取，將脂質(zhì)體與細(xì)胞共同孵育4 h后，將細(xì)胞用PBS漂洗3次，加入2μg/mL DAPI溶液，室溫孵育30 min，加冰PBS漂洗3次，加4%多聚甲醛固定15 min，棄去多聚甲醛，用冰PBS保存。置激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞攝取。

1.5 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) TF-LP-DOX/Rg3對(duì)MKN-28細(xì)胞的增殖抑制作用 培養(yǎng)MKN-28細(xì)胞接種于96孔板中，107個(gè)/孔。當(dāng)孔板中細(xì)胞完全貼壁且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)加入經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾的脂質(zhì)體20μL，使每孔最終含阿霉素約0.25μg/mL和Rg311μg/mL。將孔板移入37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h和 48 h后取出，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20μL，繼續(xù)孵育4 h，將孔板中液體倒出，每孔加入DMSO 200μL，37℃避光振搖15 min，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定各孔的光密度值（optical density，OD），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6 腫瘤球的構(gòu)建 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN-28細(xì)胞用0.125%胰酶消化后，用含血清的培養(yǎng)基中和胰酶，并將細(xì)胞吹打下來(lái)后離心，棄去上清液用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種于用低熔點(diǎn)瓊脂糖預(yù)處理的96孔板中，將96孔板移入37℃CO2孵箱中培養(yǎng)。7天后成長(zhǎng)為腫瘤球。

為了考察不同脂質(zhì)體對(duì)腫瘤球的穿透能力，腫瘤球生長(zhǎng)7天后，分別加入載阿霉素的TFLP和LP，加培養(yǎng)基調(diào)整脂質(zhì)體的終濃度為120 nmol·mL-1。37℃孵育4 h后，將腫瘤球用PBS漂洗三次，加4%多聚甲醛固定15 min，棄去多聚甲醛，用冰PBS保存。置激光共聚焦顯微鏡觀察腫瘤球攝取。

為了考察不同載藥脂質(zhì)體對(duì)腫瘤球生長(zhǎng)的抑制作用，腫瘤球生長(zhǎng)7 d后，加入TF-LP-DOX/Rg3、TF-LP-DOX、TF-LPRg3和LP-DOX/Rg3。以PBS為陰性對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)腫瘤球體積大小變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)以“x±s”表示：使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：2組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的粒徑、電位以及包封率 制備得到的各種脂質(zhì)體的粒徑均在130 nm左右，PDI小于0.3。阿霉素和Rg3的包封率分別為93.5%和82.2%(見表1)。

表1 脂質(zhì)體的粒徑，電位以及包封率（n=3）Tab.1 Characteristics of liposomes: particle size, size distribution, zeta-potential and entrapment ef fi ciency (n=3)

2.2 TF-LP-DOX的體外腫瘤細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 在MKN-28細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體高度表達(dá)。細(xì)胞攝取的定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示：脂質(zhì)體與腫瘤細(xì)胞共孵育4 h后，MKN-28細(xì)胞對(duì)TF-LP-DOX攝取效率是普通脂質(zhì)體的2.9倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。MKN-28細(xì)胞在4 h的攝取量是2 h的1.8倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。定性的激光共聚焦熒光倒置顯微鏡觀察結(jié)果如圖1所示，TF-LP組熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于普通脂質(zhì)體，這與定量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

表2 MKN-28細(xì)胞對(duì)不同脂質(zhì)體的攝取效率（n=3）Tab.2 Uptake ef fi ciency of different liposomes by MKN-28 cells (n=3)

圖1 激光共聚焦觀察MKN-28細(xì)胞對(duì)載阿霉素脂質(zhì)體的攝取(×1000).Fig.1 Uptake of doxorubicin loaded liposomes by MKN-28 cells based on confocal laser scanning microscopy(×1000)

2.3 TF-LP-DOX/Rg3抑制MKN-28細(xì)胞的增殖TF-LP-DOX/Rg3對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增長(zhǎng)，TF-LP-DOX/Rg3在24 h對(duì)MKN-28細(xì)胞的抑制率是48 h的1.88倍（P＜0.01）；給藥48 h后，TF-LP-DOX/Rg3對(duì)MKN-28細(xì)胞的抑制率是TF-LP-DOX、TF-LP-Rg3和LPDOX/Rg3的1.93倍、2.44倍和3.15倍（P＜0.01，見圖2)。

圖2 不同脂質(zhì)體對(duì)MKN-28細(xì)胞的抑制率*P＜0.01，與24 h TF-LP-DOX/Rg 3 組相比；◇P＜0.01，與TF-LP-DOX、TF-LP-Rg 3 and LP-DOX/Rg 3 組相比Fig.2 The inhibition rates of cells at various drugs at 24 h and 48 h after the treatment*P＜0.01，compared with TF-LP-DOX/Rg 3 group at 24 h；◇P＜0.01，compared with TF-LP-DOX，TF-LP-Rg 3 and LP-DOX/Rg 3 group

2.4 TF-LP-DOX/Rg3的腫瘤球穿透性和腫瘤球生長(zhǎng)抑制作用 腫瘤球穿透實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，普通脂質(zhì)體組紅色熒光只在腫瘤球表面少量分布。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾后脂質(zhì)體的阿霉素紅色熒光在腫瘤球中均勻分布。

圖3 載阿霉素脂質(zhì)體對(duì)MKN-28腫瘤球的穿透實(shí)驗(yàn)(×1000)Fig.3 Uptake of doxorubicin loaded liposomes by MKN-28 tumor spheroids based on confocal laser scanning microscopy(×1000)

圖4 給藥7天后腫瘤球體積變化*P＜0.01， 與TF-LP-DOX、TF-LP-Rg 3 and LP-DOX/Rg 3 組相比Fig.4 The change ratio of tumor spheroid after 7 days*P＜0.01， compared with TF-LP-DOX，TF-LP-Rg 3 and LP-DOX/Rg 3 groups

腫瘤球生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)結(jié)果所示（見圖4），MKN-28胃癌細(xì)胞腫瘤球給藥7 d后TF-LP-DOX、TF-LP-Rg 3、LP-DOX/ Rg3和TF-LP-DOX/Rg3分別使腫瘤體積減小到原體積的64%、79%、71%和45%，生理鹽水組腫瘤球體積增大1.22倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

隨著功能性納米給藥系統(tǒng)研究的發(fā)展，高選擇性的高效藥物傳遞系統(tǒng)為包括腫瘤等疾病的治療帶來(lái)了新的希望[9-11]。納米給藥系統(tǒng)能夠包載水不溶性藥物，降低細(xì)胞毒藥物的毒副作用以及根據(jù)腫瘤特點(diǎn)進(jìn)行表面修飾實(shí)現(xiàn)腫瘤主動(dòng)靶向給藥。Rg3是從人參中提取的一種單體成分。有研究證實(shí)：Rg3對(duì)包括肺癌[12]、肝癌[13]、結(jié)腸癌[14]和乳腺癌[15]等腫瘤疾病都有很好的療效。本研究構(gòu)建了轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾共載阿霉素和人參皂苷Rg3的脂質(zhì)體，并對(duì)其體內(nèi)外靶向性和抗腫瘤活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

本研究通過(guò)后插法制備的TF-LP-DOX/Rg 3，粒徑在130 nm左右，得到了一個(gè)理想的納米粒徑。DOX和Rg3的包封率都在80%以上。雙載藥脂質(zhì)體與阿霉素脂質(zhì)體和Rg3脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性比較結(jié)果顯示，阿霉素和Rg3共載藥后能夠顯著增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制能力。定性和定量的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾后，胃癌MKN-28細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的攝取能力顯著增強(qiáng)，這是由腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體高效介導(dǎo)脂質(zhì)體入胞。這與體外腫瘤細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)的結(jié)果相一致，說(shuō)明共載藥脂質(zhì)體的細(xì)胞增殖抑制作用依賴于腫瘤細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的攝取。本研究構(gòu)建了胃癌MKN-28細(xì)胞體外腫瘤球模型模擬脂質(zhì)體的腫瘤球穿透能力和腫瘤球生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的共載阿霉素和Rg3脂質(zhì)體能夠高效穿透腫瘤球，且對(duì)腫瘤球的生長(zhǎng)抑制作用顯著強(qiáng)于其他脂質(zhì)體。綜上所述，本研究構(gòu)建了轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的共載阿霉素和Rg3脂質(zhì)體是一種潛在的胃癌靶向給藥系統(tǒng)。其體內(nèi)靶向性和體內(nèi)抗胃癌作用正在研究中。

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TF modi fi ed doxorubicin and Rg3 loaded liposome for gastric cancer targeting and therapy

LI Hua1, HU Shi-lin2, WANG Hai-long3, ZHU Zhi-tu1△
（1. Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121000,China; 2. Department of General surgery, People's Hospital of Beizhen City, Beizheng 121307,China; 3 Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121000, China）

ObjectiveTo prepare TF conjugated doxorubicin and Rg 3 loaded liposome and evaluate their properties and effect on the treatment of gastric cancer。MethodThe liposomes were prepared by thin fi lm hydration method. The ef fi ciency of cellular uptake on MKN-28 cells in vitro was evaluated. The anti-proliferation ef fi ciency of TF-LP-DOX/Rg 3 was evaluated by MTT assay. Tumor spheroids were used to evaluate anti-tumor ability of TF-LP-DOX/Rg 3。ResultsThe result demonstrated that TF-LP uptaken by MKN-28 were 2.9 times higher than that of LP（P＜0.01）. The MTT assay and the inhibition of tumor spheroids in vitro con fi rmed strong inhibitory effect of TF-LP-DOX/Rg 3。ConclusionTF-LP-DOX/Rg 3 easily prepared and it is a potential delivery system for the treatment of gastric cancer.

transfferin; doxorubicin; Rg 3; liposome

R 735.2

A

1005-1678(2014)01-0009-04

遼寧省自然科學(xué)基金（3013022070）

李華，女，博士在讀，主治醫(yī)師，研究方向：消化道腫瘤的基礎(chǔ)與臨床，Email：1096485971@qq.com。朱志圖，通信作者，男，博士，副教授，研究方向：消化道腫瘤的基礎(chǔ)與臨床，Email：lyyyzhe@163.com。