陶利，曹學(xué)成，周金輝

（1.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院 藥劑科，山東 濟(jì)南 250031；2.山東濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 濟(jì)寧 276826）

星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化飛揚(yáng)草提取工藝研究

陶利1，曹學(xué)成1，周金輝2Δ

（1.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院 藥劑科，山東 濟(jì)南 250031；2.山東濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 濟(jì)寧 276826）

目的利用星點(diǎn)-效應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)化飛揚(yáng)草的最佳乙醇超聲提取工藝。方法以飛揚(yáng)草中槲皮苷的含量為指標(biāo)，選取乙醇濃度、提取時間、溶劑倍量3個因素進(jìn)行考察，結(jié)合單因素實驗法和星點(diǎn)-效應(yīng)面設(shè)計法對飛揚(yáng)草的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果飛揚(yáng)草的最佳提取工藝為：乙醇濃度為60%，提取時間為50min，溶劑倍量為10，在此提取條件下平均提取量為2.39mg／g。結(jié)論采用本實驗方法優(yōu)化飛揚(yáng)草的提取工藝，簡便合理。

飛揚(yáng)草；響應(yīng)面法；槲皮苷；超聲提取

1.2 含量測定方法的建立［6-7］

1.2.1 飛揚(yáng)草的提?。簩w揚(yáng)草藥材，去雜質(zhì)，置于烘箱中60℃干燥12 h，粉碎。各取10 g，精密稱定，將不同超聲時間（功率100W，頻率40 KHz）提取的飛揚(yáng)草提取液濃縮，用提取時相應(yīng)濃度的提取溶液定容至25m L，精密吸取1 mL，再用甲醇溶解并定容至10mL，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2 色譜條件［8］：色譜柱 Agilent TC-C18（4.6 mm×250mm，5μm）；流動相為乙腈：0.1%磷酸水（25∶75）；檢測波長：256 nm；流速：1.0mL／min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL。

1.2.3 對照品溶液的制備：精密稱取槲皮苷對照品適量，加甲醇制得槲皮苷含量為0.05mg／mL對照品溶液，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

1.2.4 線性關(guān)系考察：分別緊密吸取槲皮苷對照品溶液1、2、4、6、8、10mL，用甲醇稀釋成一系列的濃度溶液，按 2.1.1.項下方法測定峰面積，以槲皮苷的濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（S）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：S＝59820C＋672.9，R2＝0.9989，表明槲皮苷在5.0～50.0μg／mL的濃度范圍內(nèi)，與其色譜峰的峰面積的積分值線性關(guān)系良好。

2 結(jié)果

2.1 單因素考察

2.1.1 考察乙醇濃度對槲皮苷提取量的影響：精密稱取飛揚(yáng)草各10g，分別用40%、50%、60%、70%、80%的乙醇作為提取溶劑，以溶劑倍量為8，超聲提取30min，按1.2.1項下條件進(jìn)行測定，考察乙醇濃度對槲皮苷提取量的影響，結(jié)果見圖1。由圖可知，隨著乙醇濃度的升高，飛揚(yáng)草中槲皮苷的提取量逐漸增大，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時，槲皮苷的提取量達(dá)到最大值，之后隨著乙醇濃度的增加，槲皮苷含量反而下降，其原因可能是槲皮苷是種極性高的黃酮類化合物，故60%為乙醇最佳濃度。

圖1 乙醇濃度對槲皮苷提取量的影響Fig.1 The effect of the ethanol concentration to the retrieval amount of quercitroside

2.1.2 考察提取時間對槲皮苷提取量的影響：精密稱取飛揚(yáng)草各 10 g，以提取時間 30、40、50、60、70 min進(jìn)行超聲提取，以溶劑倍量為8，乙醇濃度60%，按1.2.1項下條件進(jìn)行測定，考察提取時間對槲皮苷提取量的影響，結(jié)果見圖2。研究結(jié)果表明，飛揚(yáng)草中槲皮苷的提取量隨著提取時間的增加而升高，當(dāng)提取時間為50min時，槲皮苷的提取量取得較大值，此后隨著時間的延長，提取量沒有顯著的變化，可能是因為槲皮苷的溶出已較為完全，故選擇50min為最佳提取時間。

圖2 提取時間對槲皮苷提取量的影響Fig.2 The effect of the extraction time to the retrieval amount of quercitroside

2.1.3 考察溶劑倍量對槲皮苷提取量的影響：精密稱取飛揚(yáng)草各10 g，以溶劑倍量 6、8、10、12、14，以 60%乙醇為提取溶劑，超聲提取50min，按1.2.1項下條件進(jìn)行測定，考察溶劑倍量對槲皮苷提取量的影響，結(jié)果見圖3。有圖可知，隨著溶劑倍量的增加，槲皮苷的提取量上升到一定程度后，增加量沒有顯著變化，故選定10為溶劑倍量。

圖3 溶劑倍量對槲皮苷提取量的影響Fig.3 The effect of the volume of solvent to the retrieval amount of quercitroside

2.2 星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝［9-10］在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選擇對飛揚(yáng)草提取效果影響較顯著的3個因素作為考察指標(biāo)，即乙醇濃度（A），提取時間（B），溶劑倍量（C），以槲皮苷在不同提取中的含量為指標(biāo)，采用三因素，三水平的Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝［11-12］，見表 1、表 2。

表1 各因素水平的代碼值及實際物理量Tab.1 The code value of each factor level and the actual physical quantities

采用Design-Expert軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，以槲皮苷含量對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合得到回歸方程：Y＝2.38＋0.033A＋0.055B＋0.07C－0.02AB＋0.04BC－0.09B2－0.085C2，r＝0.9908，P＜0.0001；根據(jù)回歸方程可得，二次多項式擬合結(jié)果較好。方程回歸分析及方差分析結(jié)果見表3，并根據(jù)二次回歸方程繪制響應(yīng)面曲線，能得到兩個因素交互作用對響應(yīng)值Y的影響，結(jié)果見圖4。分析可知，各因素對槲皮苷提取量的影響由大到小依次為：溶劑倍量C＞提取時間B＞乙醇濃度A；在3個因素中，提取時間及溶劑倍量之間的交互作用對響應(yīng)面的影響曲線較陡，等高線的數(shù)目也多于其他兩兩之間的交互作用，故提取時間和溶劑倍量對槲皮苷的提取量具有非常顯著的影響（P＜0.01）。

2.3 最佳處方的驗證 采用Design-Expert V8.0.6軟件分析數(shù)據(jù)，得到飛揚(yáng)草中槲皮苷提取的理論最佳工藝條件為：乙醇濃度為61.1%，提取時間為51.9min，溶劑倍量為10.3。在此條件下預(yù)測槲皮苷的提取量為2.45mg／g。根據(jù)實際試驗操作，按乙醇濃度60%，提取時間50min，溶劑倍量10，對飛揚(yáng)草進(jìn)行3次平行驗證試驗，測得槲皮苷的平均提取量為2.39 mg／g。結(jié)果表明，試驗優(yōu)化的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

表3 回歸系數(shù)顯著性分析Tab.3 Analysis of significance of regression coefficient

圖4 槲皮苷含量對乙醇濃度（A）、提取時間（B）及溶劑倍量（C）的三維效應(yīng)面圖Fig.4 The 3D effect graph of the quercitroside content to the ethanol concentration（A），the extraction time（B）and the volume of solvent（C）

3 討論

本文先通過單因素實驗，考察了乙醇濃度、提取時間、溶劑倍量對槲皮苷的提取量的影響，再進(jìn)一步用星點(diǎn)-效應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)選對槲皮苷提取量影響較大的3個因素乙醇濃度和提取時間和溶劑倍量［13-14］，結(jié)合實驗具體操作得到最佳超聲提取時間為：乙醇濃度為60%，提取時間為50min，溶劑倍量為10，提取效果較好，為飛揚(yáng)草的批量提取及進(jìn)一步研制飛揚(yáng)草的相關(guān)劑型提供參考。相較傳統(tǒng)煎煮法，本研究采用超聲波提取法，具有時間短、效率高的特點(diǎn)，可以有效避免溫度過高造成的有效成分損失。而乙醇對有效成分槲皮苷有較好的溶解度，醇提物雜質(zhì)相對較少。飛揚(yáng)草為民族中藥材，具有較強(qiáng)的抗炎鎮(zhèn)痛作用，相關(guān)報道還較少。化學(xué)成分表明，飛揚(yáng)草中主要成分為黃酮苷、酚類和三萜等［15］。同時藥理研究表明，飛揚(yáng)草總黃酮對急性炎癥有明顯的抑制作用，具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用［16］。依據(jù)藥典中對飛揚(yáng)草的含量測定方法，選用有效成分槲皮苷作為評價指標(biāo)進(jìn)行實驗。

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（編校：李璐璐）

Studies on optim izing extraction technology of Euphorbia hirta L.by central com posite design-response surfacemethodology

TAO Li，CAO Xue-cheng，ZHOU Jin-hui

（1.Department of Pharmacy，Jinan Military General Hospital，Jinan 250031，China；2.School of Medicine，Jining Medical University，Jining 276826，China）

ObjectiveTo optimize the extraction process of Euphorbia hirta L.by Central composite design／response surface methodology with ethanol by the ultrasonic extraction technology.MethodsBased on the single factor experiment and central composite design-response surface methodology，the content of quercitroside was regarded as evaluation index，select ethanol concentration，extraction time，and solid-liquid ratio as three evaluation factors to achieve the purpose.ResultsThe results indicated that the optimal extraction processwas obtained as follows：10 times the amount of60%ethanol under ultrasound for 2 times，50min each；the average content of the quercitrosidewas2.39mg／g.ConclusionThemethod to optimize the extraction process is simple and reasonable.

Euphorbia hirta L.；central composite design-response surface thodology；Quercitroside；ultrasonic extraction

R932

A

1005－1678（2014）04－0161－03

飛揚(yáng)草是大戟科植物飛揚(yáng)草Euphorbia hirta L.的干燥全草。飛揚(yáng)草具有清熱解毒，利濕止癢，通乳的功效。用于肺癰，乳癰，疔瘡腫毒，牙疳，痢疾，泄瀉，熱淋，血尿，濕疹，腳癬，皮膚瘙癢，產(chǎn)后少乳等癥［1］?；瘜W(xué)成分研究表明，其主要成分為黃酮苷、酚類和三萜等［2］。藥理研究表明，飛揚(yáng)草總黃酮具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用，對急性炎癥有抑制作用［3］。據(jù)文獻(xiàn)報道及2010版中國藥典，本研究選擇黃酮類成分中的有效成分槲皮苷進(jìn)行定量研究［4-5］，采用星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法擬合數(shù)據(jù)模型，優(yōu)化飛揚(yáng)草中槲皮苷的提取工藝，以便為進(jìn)一步的制劑開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 Agilent1100型高效液相色譜儀；VWD檢測器；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHB-3型循環(huán)水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠）；DZKW-C型電子恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；槲皮苷對照品由中國藥品生物鑒定所鑒定（批號：111538-201402）；飛揚(yáng)草藥材（購自成都市荷花池中藥材市場）經(jīng)濟(jì)南市食品藥品監(jiān)督管理局鑒定為合格藥材；乙腈（色譜純，天津四友）；超純水自制；其他試劑均為分析純。

全軍“十一五”醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金（6J-006）

陶利，女，碩士，副主任藥師，研究方向：臨床藥學(xué)，郵箱：694831261＠qq.com；周金輝，通信作者，男，博士，副教授，研究方向：藥物分析，郵箱：2332294065＠qq.com。