吳 為，李琴山，宋 偉，繆時英，王琳芳

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100005

·論 著·

串聯(lián)親和純化技術(shù)篩選Bat3的相互作用蛋白質(zhì)

吳 為，李琴山，宋 偉，繆時英，王琳芳

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100005

目的尋找與Bat3結(jié)合的蛋白質(zhì)。方法采用串聯(lián)親和純化技術(shù)，在Bat3編碼序列羧基端融合Strep2和FLAG 2個分子標(biāo)簽，以此為誘餌篩選與其特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，最后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果篩選到1種蛋白質(zhì)分子，命名為Ubl4A，免疫共沉淀結(jié)果顯示Ubl4A可與Bat3相互結(jié)合。結(jié)論成功建立了串聯(lián)親和純化技術(shù)平臺，分離出可與Bat3相互作用的蛋白質(zhì)Ubl4A。

Bat3;凋亡;串聯(lián)親和純化

材料和方法

材料與試劑Pfu Taq DNA polymerase、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購自美國NEB公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國GIBCO公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司;Anti-strep2珠子購自德國IKA公司，Anti-Flag珠子購自美國Sigma公司，Biotin、3x-flag多肽購自美國Sigma公司。根據(jù)NCBI中Bat3基因序列，利用PRIMER PREMIER軟件設(shè)計引物：上游為TAAGCTAGCGCCACCATGGAGCCTAATGATAGTACCAG，下游為 AATACGCGTAGGATCATCAGCAAAGGCC。

載體構(gòu)建及融合蛋白表達(dá)的檢測以plentilox 3．7慢病毒表達(dá)質(zhì)粒為母體，去掉其U6啟動子區(qū)，插入帶內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點-增強型綠色熒光蛋白 (internal ribosome entry site-enhanced green fluorescence protein，IRES-EGFP)的巨細(xì)胞病毒啟動子，將其改造為適合于過表達(dá)的慢病毒載體。改造后質(zhì)粒的多克隆位點 為 EcoR1-Nhe1-Sma1-Mlu1-BamH1，在 Mlu1和BamH1之間插入Strep2-FLAG這兩個標(biāo)簽序列，在Nhe1和Mlu1之間插入Bat3表達(dá)序列。通過lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染Bat3表達(dá)質(zhì)粒，Western blotting檢測Strep2和FLAG標(biāo)簽的表達(dá)。

包裝病毒及感染293T細(xì)胞按照10 μg∶10 μg∶10 μg∶20 μg 的劑量，將慢病毒包裝輔助質(zhì)粒 plp1、plp2、VSVG與慢病毒過表達(dá)Bat3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至1個150 mm培養(yǎng)皿的293T細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染48、72 h后分別收集1次培養(yǎng)上清。將兩次收集的上清超速離心，18 000 r/min離心3 h，得到的病毒沉淀用200 μl PBS溶解。分裝，凍于-80℃冰箱。按照1∶50的比例將病毒原液加入到培養(yǎng)上清中感染293T細(xì)胞，72 h后熒光顯微鏡觀察表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞的比例。

串聯(lián)親和純化收集5盤150 mm培養(yǎng)皿穩(wěn)定表達(dá)Bat3的細(xì)胞，向細(xì)胞沉淀中加入5 ml NTEN裂解液，裂解20 min，14 000 r/min離心30 min。向細(xì)胞上清加入400 μl anti-Strep2 beads，孵育1 h，NTEN裂解液洗滌beads 3遍，加入1．2 ml含2 mg/ml的生物素洗脫液，洗脫2次。合并洗脫液，加入100 μl anti-FLAG beads，孵育1 h，NTEN裂解液洗滌beads 3遍，加入300 μl含0．2 mg/ml 3x-flag肽段，洗脫 2次，收集洗脫液，超濾濃縮至30 μl體積。

質(zhì)譜分析將濃縮后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后行考馬斯亮藍(lán)染色，切下與對照組有明顯差異的條帶，送至清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)中心做Malti-TOF蛋白質(zhì)鑒定，得到的肽段序列與NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫對比檢索。

免疫共沉淀按照實驗設(shè)計將帶有FLAG標(biāo)簽的Bat3表達(dá)質(zhì)粒和帶有Myc標(biāo)簽的Ubl4A表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞內(nèi)，48 h后收集細(xì)胞，NTEN裂解液裂解細(xì)胞，離心后上清液中加入10 μl anti-FLAG beads和10 μl protein-G beads，孵育1 h，用 NTEN洗滌3遍，加入30 μl 1．2×上樣緩沖液，制備免疫共沉淀樣品。將樣品進(jìn)行SDS-PAGE，用anti-FLAG和anti-Myc抗體進(jìn)行免疫雜交，檢測Bat3與Ubl4A的相互作用。

結(jié) 果

慢病毒Bat3表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定以人293T細(xì)胞cDNA為模板，利用所設(shè)計的引物擴增人Bat3編碼序列，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，出現(xiàn)大小約為3400 bp的DNA片段。將Bat3片段克隆到改造的plentilox3．7質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化，PCR鑒定陽性克隆，結(jié)果顯示擴增出預(yù)計的3．4 kb DNA片段 (圖1)。進(jìn)一步測序分析證實Bat3基因序列完全正確。

融合雙標(biāo)簽的Bat3表達(dá)通過lipofectamine 2000將構(gòu)建好的Bat3慢病毒表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，48 h后行Western blot檢測Bat3融合標(biāo)簽的表達(dá)情況，結(jié)果顯示用anti-FLAG與anti-Strep2一抗孵育后，發(fā)現(xiàn)在相對分子質(zhì)量130 000～170 000之間有1個目的條帶，與預(yù)期的相對分子質(zhì)量相符 (圖2)。

建立穩(wěn)定表達(dá)Bat3的293T細(xì)胞系病毒感染293T細(xì)胞72 h后，熒光顯微鏡可觀察到綠色熒光的

表達(dá)，表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞約為100%(圖3)。

圖1 PCR擴增Bat3蛋白編碼序列及PCR鑒定plenti-Bat3重組質(zhì)粒Fig 1 PCR amplification of Bat3 protein coding sequence and PCR identification of recombinant plenty-Bat3 plasmids

圖2 Western blot檢測重組慢病毒plenti-Bat3融合標(biāo)簽FLAG和Strep2的表達(dá)Fig 2 Identification of expression of the fused FLAG and Strep2 tag by Western blot analysis

圖3 慢病毒感染后293T細(xì)胞發(fā)綠色熒光Fig 3 293T cells displaying green fluorescence after lentivirus infection

Bat3相互作用蛋白質(zhì)的分離及鑒定收集5個150 mm培養(yǎng)皿的表達(dá)Bat3的293T細(xì)胞，分別用anti-Strep2 beads和anti-FLAG beads親和純化兩次，將所得的樣品進(jìn)行SDS-PAGE及考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果顯示，與對照組相比，Bat3組有明顯差異的條帶。將其中箭頭所指的差異條帶切膠送去清華質(zhì)譜中心鑒定，所得的肽段序列與NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫比對，顯示鑒定的蛋白質(zhì)為Ubl4A(圖4)。

免疫共沉淀驗證Bat3與Ubl4A相互作用按照實驗設(shè)計將表達(dá)FLAG標(biāo)簽的Bat3質(zhì)粒和表達(dá)Myc標(biāo)簽的Ubl4A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后加入FLAG beads，制備免疫共沉淀樣品。Western blot檢測其中FLAG和Myc的表達(dá)，結(jié)果顯示，Bat3與Ubl4A共轉(zhuǎn)組中可檢測到Myc表達(dá)，而在Bat3和Ubl4A單獨轉(zhuǎn)染組中沒有檢測到Myc表達(dá) (圖5)。

圖4 串聯(lián)親和純化后的電泳圖Fig 4 SDS-PAGE analysis of TAP products

圖5 免疫共沉淀檢測Bat3與Ubl4A相互作用Fig 5 Co-immunoprecipitaion detects the interaction between Bat3 and Ubl4A

討 論

本研究首先在保證讀碼框正確的前提下，將Bat3蛋白質(zhì)編碼序列與串聯(lián)的Strep2和FLAG標(biāo)簽序列融合，然后將融合了串聯(lián)標(biāo)簽的Bat3基因?qū)氲礁脑斓穆《颈磉_(dá)載體上，通過293T細(xì)胞包裝產(chǎn)生有活性的慢病毒，以293T細(xì)胞為感染對象，獲得穩(wěn)定表達(dá)融合雙標(biāo)簽Bat3基因的293T細(xì)胞系。隨后在溫和的裂解條件下，經(jīng)過Strep2 beads和FLAG beads兩次親和純化，進(jìn)行SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色，得到了與對照組相比清晰的差別條帶，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為Ubl4A分子，最后經(jīng)免疫共沉淀實驗也證實了這種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。研究表明，Ubl4A可與Bat3、TRC40形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，在尾部錨定膜蛋白的成熟與降解之間發(fā)揮關(guān)鍵性作用［6-8］。

與常規(guī)的免疫親和純化相比，串聯(lián)親和純化通過兩步純化步驟，富集了差異條帶，降低了樣品中的非特異蛋白質(zhì)背景，同時由于整個純化過程都處于類似生理條件下，能夠很好的模擬體內(nèi)狀態(tài)下的蛋白質(zhì)相互作用。然而在本研究中，TAP這套系統(tǒng)還是有一些不足。為了獲得更加接近于體內(nèi)的結(jié)果，靶蛋白的表達(dá)量應(yīng)該維持或接近于體內(nèi)正常生理表達(dá)水平［9］。Bat3是一個核質(zhì)穿梭蛋白，在不同生理條件下，Bat3的定位不同。本研究中采用巨細(xì)胞病毒啟動子驅(qū)動Bat3的過表達(dá)，CMV是一個十分強大的啟動子，促使Bat3蛋白質(zhì)表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于體內(nèi)自然水平。這樣，一方面會引起非特異性的蛋白質(zhì)相互作用，另一方面改變了Bat3的定位，促進(jìn)了非生理條件下蛋白質(zhì)相互作用的產(chǎn)生。此外，由于蛋白質(zhì)之間的相互作用親和力有強有弱，TAP經(jīng)過多次漂洗過程，其中親和力較弱的蛋白質(zhì)相互作用易在漂洗過程中丟失，不易被撲捉到［10］。為了改進(jìn)這些問題，本課題組正在嘗試腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的同源重組技術(shù)，將Strep2和FLAG雙標(biāo)簽導(dǎo)入到細(xì)胞的Bat3基因組中，這樣就能真正模擬體內(nèi)的生理條件。同時將細(xì)胞用DSS等偶聯(lián)劑處理，將微弱的蛋白質(zhì)相互作用固定，大大增加撲捉較弱的相互作用的機會?？傊?，通過不斷的改進(jìn)，串聯(lián)親和純化技術(shù)是一項極具潛力的分離相互作用蛋白質(zhì)的工具。

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Identification of Proteins Interacted with Bat3 Using Tandem Affinity Purification

WU Wei，LI Qin-shan，SONG Wei，MIAO Shi-ying，WANG Lin-fang

National Laboratory of Medical Molecular Biology，Institute of Basic Medical Sciences，CAMS and PUMC，Beijing 100005，China

WANG Lin-fang Tel：010-69156418，E-mail：wang．linfang@imicams．a(chǎn)c．cn

ObjectiveTo identify the specific protein interactions involved in Bat3-mediated apoptosis．MethodsTandem affinity purification(TAP)was utilized to investigate Bat3-protein interactions，during which full-length human Bat3 fused with Strep2 and FLAG tag as a bait was used to screen the specific proteinprotein interactions．The isolated proteins were identified with mass spectrometry．ResultsTAP studies showed that Ubl4A was identified as a Bat3-binding partner．Further investigation using co-immunoprecipitation confirmed that Bat3 was associated with Ubl4A．ConclusionTAP was successfully established and is suitable for isolating the binding partners of Bat3．

Bat3;apoptosis;tandem affinity purification

王琳芳 電話：010-69156418，電子郵件：wang．linfang@imicams．a(chǎn)c．cn

Q-31

A

1000-503X(2014)01-0001-04

10．3881/j．issn．1000-503X．2014．01．001

Acta Acad Med Sin，2014，36(1)：1-4

細(xì)胞凋亡也稱為程序性細(xì)胞死亡，在維持機體發(fā)育及自身穩(wěn)態(tài)方面可發(fā)揮重要作用。細(xì)胞凋亡是一個多基因嚴(yán)格調(diào)控、高度有序的過程，一旦失控可導(dǎo)致惡性腫瘤、神經(jīng)退行性病變、自身免疫性疾病等相關(guān)疾病。Bat3又名Bag6/Scythe，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮重要作用［1］。Bat3基因敲除小鼠在胚胎期就已死亡，肺、肝、腎、睪丸等組織明顯發(fā)育不良，組織切片顯示細(xì)胞凋亡比例明顯增加［2］。目前研究表明，Bat3主要通過與其他蛋白質(zhì)結(jié)合而發(fā)揮作用，例如，其可與淀粉前體蛋白樣蛋白-2(amyloid precursor-like protein 2，APLP2)相互作用，增加APLP2的表達(dá)而拮抗細(xì)胞凋亡［3］。然而，由于基因在不同的發(fā)育器官、不同的發(fā)育階段存在表達(dá)特異性，因此尋找Bat3不同的相互作用蛋白對于深入了解Bat3的生理病理功能具有十分重要的意義。串聯(lián)親和純化是由Rigaut等［4］于1999年建立的，他們通過表達(dá)融合兩種不同親和標(biāo)簽分子的靶蛋白，經(jīng)過兩步親和層析，分離純化與靶蛋白特異結(jié)合的相互作用蛋白質(zhì)。其優(yōu)點在于可以模擬體內(nèi)生理條件，高效、特異地分離蛋白質(zhì)聚合物。與傳統(tǒng)的親和純化技術(shù)相比，該技術(shù)篩選到的相互作用蛋白假陽性率較低，大大降低了后續(xù)工作的難度［5］。本研究通過構(gòu)建串聯(lián)親和純化這個技術(shù)平臺并結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)，分離得到了與Bat3結(jié)合的蛋白質(zhì)，以期為闡述Bat3的生理功能及作用機制提供理論基礎(chǔ)。

國家重大研究計劃項目 (2011CB944302)和國家重點實驗室專項基金 (2060204)Supported by the National Important Research Plan of China(2011CB944302)and the State Key Laboratory Special Fund of China(2060204)

2013-05-17)