楊清滔，谷 江，張永春，朱致暉，楊永安，王 楠，祝慶亮

1貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，貴陽(yáng) 550004

2江都人民醫(yī)院泌尿外科，江蘇揚(yáng)州 225200

·論 著·

斯鈣素蛋白-1和缺氧誘導(dǎo)因子-1α的相互作用對(duì)腎癌細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)穩(wěn)定的影響

楊清滔1，谷 江1，張永春1，朱致暉1，楊永安1，王 楠1，祝慶亮2

1貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，貴陽(yáng) 550004

2江都人民醫(yī)院泌尿外科，江蘇揚(yáng)州 225200

目的研究斯鈣素蛋白-1(STC-1)和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)相互作用后的調(diào)鈣功能對(duì)腎癌細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)穩(wěn)定的影響。方法構(gòu)建高表達(dá)HIF-1α的腎癌細(xì)胞模型，采用不同濃度STC-1蛋白分別干預(yù)荷基因腎癌細(xì)胞和單純腎癌細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，RT-PCR和ELISA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HIF-1α和STC-1的基因及蛋白表達(dá)情況，熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化，熒光分光光度計(jì)檢測(cè)線粒體膜電位 (Δψm)，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)。結(jié)果HIF-1α基因轉(zhuǎn)染、STC-1干預(yù)及基因轉(zhuǎn)染后再STC-1干預(yù)3種方式均可提高Δψm，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+和mPTP水平，促進(jìn)細(xì)胞增殖 (P均＜0．05)，以上結(jié)果可隨著STC-1濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，但細(xì)胞增殖率的升高趨勢(shì)卻逐漸減緩。結(jié)論HIF-1α可能通過(guò)促進(jìn)STC-1表達(dá)，下調(diào)Ca2+水平，從而穩(wěn)定線粒體膜電勢(shì)來(lái)參與腎癌細(xì)胞的惡性增殖，但此作用亦因外源性STC-1對(duì)HIF-1α的抑制而逐漸減弱。

腎癌細(xì)胞;斯鈣素蛋白-1;缺氧誘導(dǎo)因子-1α;線粒體

Acta Acad Med Sin，2014，36(1)：12-19

腫瘤細(xì)胞侵襲性、異型性的生理特性可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)相對(duì)乏氧環(huán)境產(chǎn)生，同時(shí)，乏氧亦能下調(diào)呼吸鏈電子傳遞速度，促氧化磷酸化解偶聯(lián)，最終影響線粒體供能［1］。線粒體膜電位 (mitochondrion membrane potential，Δψm)與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔 (mitochondrion permeability transition pore，mPTP)不僅可衡量線粒體結(jié)構(gòu)和功能的正常與否，亦與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)［2］。研究顯示，腫瘤細(xì)胞在乏氧刺激下可反應(yīng)性促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子-1α (hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)的表達(dá)［3］，使其適應(yīng)乏氧環(huán)境，而HIF-lα又是低氧誘導(dǎo)斯鈣素蛋白-1(stanniocalcin1，STC-1)表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［4］。STC-1是一種高表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，作用于細(xì)胞線粒體，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡的糖蛋白，在多種實(shí)體瘤組織內(nèi)高表達(dá)［5］。Ca2+作為重要的第二信使，與線粒體離子平衡、陰離子蛋白交換、電荷轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)并影響mPTP，調(diào)控Δψm［6］。本研究采用外源性STC-1干預(yù)高表達(dá)HIF-1α的腎癌細(xì)胞模型，研究了STC-1與HIF-1α的相互作用，探討了兩者的調(diào)鈣功能對(duì)線粒體膜電勢(shì)穩(wěn)定性的影響。

材料和方法

質(zhì)粒、細(xì)胞和菌株pcDNA3．0-HIF-1α質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，大腸桿菌DH5α菌種為貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室保存，人腎癌GRC-1細(xì)胞株由上海弗雷堡生物公司提供。

主要試劑MTT(美國(guó)Sigma公司)，RPMI1640(美國(guó)Hyclone公司)，胎牛血清 (杭州四季青公司)，STC-1(以色列 Prospec公司)，G418(北京 Solarbio公司)，總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR MasterMix(加拿大 Fermentas公司)，ELISA試劑盒(美國(guó)R＆D公司)，F(xiàn)ura-2/AM鈣離子探針 (碧云天生物技術(shù)研究所)，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑 (美國(guó)Invitrogen公司)。

細(xì)胞培養(yǎng)GRC-1細(xì)胞置于25 cm2培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清及1%青霉素、鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液于5%CO2、37℃下培養(yǎng)。

HIF-1α重組質(zhì)粒的鑒定由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建重組質(zhì)粒后，取pcDNA3．0-HIF-1α陽(yáng)性克隆經(jīng)BamHⅠ和XbarⅠ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳回收擴(kuò)增片段，并由大連寶生物公司經(jīng)3730XL型DNA自動(dòng)測(cè)序儀檢測(cè)基因序列。

HIF-1α克隆細(xì)胞的篩選質(zhì)粒序列鑒定吻合后，采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，按照說(shuō)明書(shū)將pcDNA3．0-HIF-1α、空載體分別轉(zhuǎn)染GRC-1細(xì)胞株，37℃培養(yǎng)48 h，待細(xì)胞匯合度約80% ～90%時(shí)棄培養(yǎng)基，加800 μg/ml G418篩選培養(yǎng)基，每4 d更換1次篩選培養(yǎng)基，待單克隆細(xì)胞團(tuán)形成后傳代培養(yǎng)，分別命名為轉(zhuǎn)染組 (pcDNA3．0-HIF-1α-GRC-1)、空載體組 (pcDNA3．0-GRC-1)，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞命名為正常組(GRC-1)。

細(xì)胞干預(yù)及分組 正常組與轉(zhuǎn)染組細(xì)胞分別使用0、0．1、0．5、1．0 nmol/L的 STC-1浸染細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，分別命名為相應(yīng)的對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。

RT-PCR檢測(cè)HIF-1α、STC-1基因表達(dá)提取各組細(xì)胞總RNA，取1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并合成cDNA。引物序列：(1) β-actin：正向：5’-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3’，反向：5’-GTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3’，片段長(zhǎng)度531 bp;(2)HIF-1α：正向：5’-TCCAGCAGACTCAAATACAAGAAC-3’，反向：5’-GTATGTGGGTAGGAGATGGAGATG-3’，片段長(zhǎng)度130 bp;(3)STC-1：正向：5’-TGAGGTCGTCCAGCTCCCAATC-3’，反向：5’-GGCACAGTGGTCTGTCTGCAGGATG-3’，片段長(zhǎng)度142 bp。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 3 min;變性94℃ 30 s，退火30 s，退火溫度均為53℃，延伸72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);終止反應(yīng)72℃ 5 min。以 β-actin作為內(nèi)參照，PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。所得條帶經(jīng)Im-ageJ軟件進(jìn)行灰度分析，以目的基因與β-actin光密度比值代表目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

ELISA檢測(cè)HIF-1α、STC-1蛋白表達(dá)采用苯甲基磺酰氟 (phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)與細(xì)胞裂解液裂解各組細(xì)胞，12 000 r/min(r=8．5 cm)離心5 min，取上清滴加于酶標(biāo)包被板中，50 μl/孔，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后每孔加入80 μl無(wú)血清培養(yǎng)基和20 μl MTT溶液，37℃孵育4 h后棄去孔內(nèi)液體，加入150 μl二甲亞砜，低速震蕩10 min后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的OD值。

熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca含量2+取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞匯合度約80%，分組處理并消化成細(xì)胞懸液，1000 r/min(r=10．4 cm)離心5 min棄上清，用D-Hanks液重懸細(xì)胞，再加入Fura-2/AM，37℃避光孵育45 min，再用D-Hanks液洗滌細(xì)胞2次，3 ml D-Hanks液重懸細(xì)胞。熒光分光光度計(jì)激發(fā)波長(zhǎng)分別為340、380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)510 nm雙波長(zhǎng)測(cè)定負(fù)載探針細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

線粒體的提取及形態(tài)學(xué)鑒定依據(jù)Sailaja等［7］的方法稍加改進(jìn)，具體為：細(xì)胞接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度約80%，分組處理后，消化離心收集細(xì)胞，使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4000 r/min(r=9．3 cm)離心10 min取上清，10 000 r/min(r=8．9 cm)離心15 min棄上清，收集沉淀為線粒體。將剛提取的線粒體均勻涂于載玻片上，加0．02%詹納斯綠B染液，覆蓋玻片浸染10 min，用高倍鏡 (10×40)觀察線粒體形態(tài)。實(shí)驗(yàn)全程均于冰面進(jìn)行，重復(fù)3次。

紫外分光光度計(jì)檢測(cè)mPTP同樣方法備線粒體懸液。各組線粒體懸液各加3 ml測(cè)定介質(zhì)P搖勻，對(duì)照組為4 ml測(cè)定介質(zhì)P，各組于540 nm 752N型紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度值，mPTP開(kāi)放程度與吸光度值呈負(fù)相關(guān)。

熒光分光光度計(jì)檢測(cè)Δψm同樣方法備線粒體懸液。各組線粒體懸液各加6．6 μl Rh123，37℃水浴箱中避光孵育30 min，于熒光分光光度計(jì)下測(cè)激發(fā)光為480 nm，發(fā)射光為525 nm的熒光強(qiáng)度，Δψm與熒光強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同處理因素對(duì)GRC-1細(xì)胞內(nèi)Ca2+、Δψm、mPTP等的影響均采用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

HIF-1α重組質(zhì)粒的測(cè)序DNA測(cè)序結(jié)果顯示，HIF-1α重組質(zhì)粒的基因序列符合Genebank上的序列(圖1)。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GRC-1效率評(píng)價(jià)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GRC-1細(xì)胞48 h后，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組HIF-1α的相對(duì)表達(dá)量為 0．702±0．090，明顯高于正常組的0．414±0．080 和空載體組的 0．442 ± 0．050(P 均 ＜0．05)，且轉(zhuǎn)染組約為正常組的1．7倍;空載體組與正常組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0．05)(圖2)。

轉(zhuǎn)染HIF-1α的GRC-1細(xì)胞中HIF-1α和STC-1的基因及蛋白表達(dá)情況轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的HIF-1α和STC-1基因及蛋白表達(dá)水平明顯高于正常組 (P均＜0．05)(圖3、4)。

圖1 pcDNA3．0-HIF-1α質(zhì)粒部分測(cè)序圖Fig 1 Part of the sequencing map of pcDNA3．0-HIF-1α plasmid

STC-1干預(yù)轉(zhuǎn)染組和正常組細(xì)胞后HIF-1α和STC-1的基因及蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，HIF-1α和STC-1基因表達(dá)在轉(zhuǎn)染組與正常組分別隨STC-1蛋白給藥濃度的增加而逐漸降低 (P均＜0．05);各轉(zhuǎn)染組均顯著高于相同劑量正常組 (P均＜0．05) (圖5、6)。HIF-1α和STC-1蛋白表達(dá)在轉(zhuǎn)染組與正常組分別隨STC-1蛋白給藥濃度的增加而逐漸降低，在中、高劑量組出現(xiàn)顯著降低 (P均＜0．05);各轉(zhuǎn)染組均顯著高于相同劑量正常組 (P＜0．05)(圖7、8)。

圖2 各組細(xì)胞HIF-1α基因表達(dá)Fig 2 Expression of HIF-1α gene in each group

圖3 各組細(xì)胞HIF-1α和STC-1的基因表達(dá)Fig 3 Expressions of HIF-1α and STC-1 genes in each group

圖4 各組細(xì)胞HIF-1α和STC-1蛋白表達(dá)Fig 4 Expressions of HIF-1α and STC-1 proteins in each group

圖5 各組細(xì)胞HIF-1α基因表達(dá)Fig 5 Expression of HIF-1α gene in each group

STC-1干預(yù)轉(zhuǎn)染組和正常組GRC-1細(xì)胞48h后的Ca2+含量低、中、高劑量組細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量顯著低于對(duì)照組 (P均＜0．05)，且隨著STC-1蛋白濃度增高而逐漸降低;各轉(zhuǎn)染組Ca2+含量顯著低于相同劑量正常組 (P均＜0．05)(圖9)。

圖6 各組細(xì)胞STC-1基因表達(dá)Fig 6 Expression of STC-1 gene in each group

圖7 各組細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)Fig 7 Expression of HIF-1α protein in each group

線粒體形態(tài)學(xué)鑒定詹納斯綠B染色結(jié)果顯示，提取的線粒體呈現(xiàn)圓形、橢圓形和桿狀的藍(lán)綠色物質(zhì)(圖10)。

STC-1干預(yù)轉(zhuǎn)染組和正常組GRC-1細(xì)胞后mPTP的變化情況與對(duì)照組相比，隨著STC-1給藥濃度的逐漸增加吸光度逐漸升高，在中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＜0．05);各轉(zhuǎn)染組吸光度顯著高于相同劑量正常組 (P均＜0．05)(圖11)。

圖8 各組細(xì)胞STC-1蛋白表達(dá)Fig 8 Expression of STC-1 protein in each group

圖9 各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平Fig 9 Level of Ca2+in each group

圖10 線粒體的詹納斯綠B染色 (×400)Fig 10 Janus green B staining of isolated mitochondria(×400)

圖11 各組細(xì)胞mPTP的變化Fig 11 Membrane permeability transition pore in each group

STC-1干預(yù)轉(zhuǎn)染組和正常組GRC-1細(xì)胞后Δψm的變化情況與對(duì)照組相比，隨著STC-1給藥濃度的逐漸增加熒光強(qiáng)度逐漸降低，在中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＜0．05);各轉(zhuǎn)染組熒光強(qiáng)度顯著低于相同劑量正常組 (P均＜0．05)(圖12)。

STC-1干預(yù)轉(zhuǎn)染組和正常組GRC-1細(xì)胞后的細(xì)胞增殖情況與對(duì)照組相比，低、中劑量組吸光度顯著增高 (P均＜0．05)，但隨著STC-1濃度增高而逐漸下降，在高劑量組雖變化不明顯，但仍顯著高于對(duì)照組 (P＜0．05);各轉(zhuǎn)染組吸光度顯著高于相同劑量正常組 (P均＜0．05)(圖13)。

圖12 各組細(xì)胞Δψm的變化Fig 12 Mitochondrion membrane potential in each group

圖13 STC-1對(duì)腎癌細(xì)胞增殖的影響Fig 13 Effect of STC-1 on the proliferation of renal carcinoma cells

討 論

腫瘤細(xì)胞較正常組織細(xì)胞生長(zhǎng)更為迅速，為了滿足其生長(zhǎng)代謝，對(duì)線粒體供能的需求也更為迫切［8］。作為“能量工廠”的線粒體產(chǎn)能的前提和基礎(chǔ)主要取決于線粒體結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)控樞紐，即mPTP與Δψm的穩(wěn)定與否［2］。mPTP是位于線粒體內(nèi)外膜之間的復(fù)合性孔道，是線粒體內(nèi)外信息交流的中心樞紐，正常情況下mPTP只允許相對(duì)分子質(zhì)量小于1500的分子通過(guò)，質(zhì)子可自由通過(guò)線粒體膜，形成穩(wěn)定的Δψm［9］。然而，腫瘤由于細(xì)胞自身代謝高、相對(duì)乏氧環(huán)境等因素使其持續(xù)存在氧化應(yīng)激，導(dǎo)致鈣超載，進(jìn)而誘發(fā)mPTP開(kāi)放［6］，但持續(xù)開(kāi)放的mPTP又將導(dǎo)致Δψm降低或喪失，這可能是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中最早發(fā)生的事件，線粒體一旦發(fā)生崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)［10］。有研究表明，HIF-1α與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵SERCA2蛋白表達(dá)及增強(qiáng)線粒體Ca2+緩沖能力，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體轉(zhuǎn)移［11］，并下調(diào)細(xì)胞膜非典型L型鈣通道表達(dá)，引起Ca2+內(nèi)流減少，從而避免鈣超載［12］。加之HIF-lα是低氧誘導(dǎo)STC-1表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［3］，而STC-1具有調(diào)節(jié)Ca2+平衡的作用，且屬于腎癌的高顯基因［4］。本研究因此建立了STC-1蛋白干預(yù)高表達(dá)HIF-1α的腎癌細(xì)胞模型，探討了STC-1和HIF-1α是否通過(guò)影響Ca2+、STC-1、HIF-1α等線粒體膜電勢(shì)穩(wěn)定相關(guān)指標(biāo)，參與腎癌細(xì)胞的惡性增殖機(jī)制。

本研究首先成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)HIF-1α的GRC-1細(xì)胞系，隨后檢測(cè)了轉(zhuǎn)染組和正常組細(xì)胞內(nèi)HIF-1α和STC-1的基因及蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組顯著高于正常組，說(shuō)明GRC-1細(xì)胞高表達(dá)HIF-1α能夠促進(jìn)自身STC-1的表達(dá)，這與HIF-lα是乏氧誘導(dǎo)STC-1表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［3］這一觀點(diǎn)相符。轉(zhuǎn)染組和正常組細(xì)胞經(jīng)不同濃度STC-1蛋白干預(yù)后，低、中、高劑量組HIF-1α和STC-1基因及蛋白表達(dá)較之相應(yīng)對(duì)照組逐漸降低，推測(cè)這可能是STC-1蛋白下調(diào)腫瘤細(xì)胞內(nèi)HIF-1α表達(dá)［13］，進(jìn)而減弱了HIF-1α刺激STC-1表達(dá)的作用，亦可能是外源性STC-1直接作用于細(xì)胞后的負(fù)反饋調(diào)節(jié)所致。橫向比較，各轉(zhuǎn)染組HIF-1α和STC-1基因及蛋白表達(dá)均顯著高于相同劑量正常組，原因可能是轉(zhuǎn)染組細(xì)胞HIF-1α高表達(dá)刺激了STC-1表達(dá)，該作用部分拮抗了STC-1蛋白下調(diào)腫瘤組織中HIF-1α的表達(dá)。從各實(shí)驗(yàn)組Ca2+含量的檢測(cè)結(jié)果可推測(cè)：STC-1蛋白可降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，且隨著STC-1蛋白濃度的增加而逐漸降低;橫向比較，Ca2+含量在各轉(zhuǎn)染組顯著低于相同劑量正常組，這與轉(zhuǎn)染組較正常組中HIF-1α和STC-1基因及蛋白的表達(dá)量上升相匹配。結(jié)合mPTP和Δψm結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，正常組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞隨STC-1蛋白給藥濃度的增加，mPTP開(kāi)放度逐漸降低，Δψm逐漸升高，且在中、高劑量組出現(xiàn)顯著差異;各劑量組細(xì)胞內(nèi)mPTP開(kāi)放度逐漸降低、Δψm逐漸升高與Ca2+含量逐漸降低相匹配。

此外本研究還發(fā)現(xiàn)，STC-1能促進(jìn)GRC-1細(xì)胞增殖，而促增殖作用隨著加入STC-1蛋白濃度的增加而降低，推測(cè)其原因可能有以下兩方面：(1)正常組細(xì)胞隨著STC-1蛋白給藥濃度的增加，HIF-1α、Ca2+水平逐漸下降，STC-1對(duì)GRC-1細(xì)胞的促增殖作用可能是通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，抑制mPTP開(kāi)放，提高Δψm，維持線粒體產(chǎn)能效應(yīng)而實(shí)現(xiàn);但HIF-1α是使細(xì)胞抗乏氧的有利基因，STC-1降低Ca2+的同時(shí)也降低HIF-1α，當(dāng)HIF-1α的表達(dá)下降到一定程度時(shí)，STC-1對(duì)細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用逐漸被HIF-1α表達(dá)下降所拮抗。(2)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)HIF-1α過(guò)表達(dá)，但隨著STC-1蛋白濃度的增加，HIF-1α、Ca2+水平逐漸下降，推測(cè)GRC-1細(xì)胞增殖活性增高的原因可能是STC-1及HIF-1α通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定而實(shí)現(xiàn);在低劑量組，STC-1蛋白對(duì)HIF-1α表達(dá)的抑制作用小于高表達(dá)HIF-1α對(duì)細(xì)胞促增殖的作用，但隨著STC-1蛋白濃度的增加，高表達(dá)HIF-1α對(duì)細(xì)胞促增殖的作用逐漸被HIF-1α表達(dá)下降所拮抗，故STC-1對(duì)細(xì)胞促增殖的作用在低劑量組出現(xiàn)一過(guò)性增高，在中、高劑量組逐漸降低。

綜上，本研究結(jié)果提示，細(xì)胞增殖活性增高的程度可能主要取決于細(xì)胞內(nèi)STC-1、HIF-1α基因和蛋白的表達(dá)程度及Ca2+水平降低，其減緩了mPTP的持續(xù)開(kāi)放，提高了Δψm，保障了線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整，維持了產(chǎn)能效應(yīng)。但HIF-1α、STC-1對(duì)mPTP、Δψm的作用是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+間接實(shí)現(xiàn)還是通過(guò)其他細(xì)胞受體途徑直接作用于線粒體，尚需深入研究。此外，HIF-1α誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)STC-1的表達(dá)與STC-1蛋白下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的表達(dá)之間是否存在劑量依賴關(guān)系，也需要對(duì)HIF-1α、STC-1進(jìn)行基因表達(dá)的定量研究。

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Effects of Stanniocalcin-1 and Hypoxia-inducible Factor-1α on Mitochondrial Membrane Potential Stability in Renal Carcinoma Cells

YANG Qing-tao1，GU Jiang1，ZHANG Yong-chun1，ZHU Zhi-hui1，YANG Yong-an1，WANG Nan1，ZHU Qing-liang2

1Department of Urologic Surgery，Affiliated Hospital，Guiyang Medical College，Guiyang 550004，China
2Department of Urologic Surgery，Jiangdu People’s Hospital，Yangzhou，Jiangsu 225200，China

GU Jiang Tel：0851-6773096，E-mail：gj0851@gmail．com

ObjectiveTo explore the effects of stanniocalcin-1(STC-1)and hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α)on the calcium and thus on the mitochondrial membrane potential(Δψm)in renal carcinoma cells．MethodsWe successfully established the renal carcinoma cell models with high HIF-1α gene expression．After various concentrations of STC-1 solutions were added to the culture medium，the proliferation of cells，expressions of HIF-1α and STC-1，levels of Ca2+，Δψm，and mPTP were detected by MTT，RT-PCR，ELISA，fluorescence spectrophotometry，and ultraviolet spectrophotometry，respectively．ResultsThe prolifer-ation of renal carcinoma cells and Δψm were improved after HIF-1α gene transfection，STC-1 protein intervention，and STC-1 protein intervention after gene transfection．While the intracellular Ca2+level and mPTP were decreased significantly(P ＜0．05)，all the changes were intensified with the gradual increase of STC-1．However，the increasing trend of cell proliferation gradually declined．ConclusionHIF-1α may participate in malignant proliferation of renal carcinoma cells by promoting STC-1 proliferation or down-regulating Ca2+;however，such an effect may be gradually attenuated due to the inhibitory effect of STC-1 on HIF-1α．

renal carcinoma cells;stanniocalcin-1;hypoxia-inducible factor-1α;mitochondria

谷 江 電話：0851-6773096，電子郵件：gj0851@gmail．com

R445．2

A

1000-503X(2014)01-0012-08

10．3881/j．issn．1000-503X．2014．01．003

貴州省科技廳社會(huì)攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目 (黔科合SY字［2011］3060)Supported by the Guizhou Province Science and Technology Department of Social Research Projects(黔科合SY字 ［2011］3060)

2013-08-23)