李雅冬

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院頜面外科，重慶 400016

·論 著·

膜蛋白AN01過表達(dá)對人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響

李雅冬

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院頜面外科，重慶 400016

電話：023-89012907，電子郵件：llxxyydd2006@sina．com

目的研究膜蛋白ANO1過表達(dá)對人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞增殖、剝脫、伸展和遷移的影響。方法以ANO1穩(wěn)定過表達(dá)的Hep-2細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)組，空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hep-2細(xì)胞作為對照組，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性，細(xì)胞剝脫實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞剝脫能力，細(xì)胞伸展實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞伸展能力，Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)、體外劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和尼氟滅酸阻斷氯離子通道實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力。結(jié)果MTT法檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對照組的光密度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0．62)。細(xì)胞剝脫實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞伸展實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞剝脫百分比 (P＜0．0001)和伸展百分比 (P＜0．0001)明顯大于對照組。Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的穿膜細(xì)胞百分比明顯大于對照組 (P＜0．0001);體外劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的劃痕面積百分比明顯小于對照組 (P＜0．0001);尼氟滅酸阻斷氯離子通道實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的劃痕面積百分比明顯大于對照組 (P＜0．0001)。結(jié)論ANO1過表達(dá)并未加快癌細(xì)胞的增殖速度，但卻大大增加了頭頸鱗癌細(xì)胞的移動、伸展和剝脫能力。

頭頸鱗癌;氯離子通道;轉(zhuǎn)移

Acta Acad Med Sin，2014，36(1)：20-24

癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是頭頸鱗癌治療失敗的主要原因［1］。筆者以往采用基因芯片技術(shù)檢測了80例頭頸鱗癌患者的臨床標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ANO1高表達(dá)與頭頸鱗癌轉(zhuǎn)移高度相關(guān)［2］。對多株頭頸鱗癌細(xì)胞株的檢測結(jié)果亦顯示，人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞內(nèi)源性ANO1表達(dá)較低。遂將含有ANO1片段的PSG-5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Hep-2細(xì)胞，成功建立了ANO1穩(wěn)定高表達(dá)的Hep-2細(xì)胞。本研究評估了膜蛋白ANO1過表達(dá)對人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞增殖、剝脫、伸展和遷移的影響，以期為今后的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下良好的基礎(chǔ)。

材料和方法

材料穩(wěn)定高表達(dá)ANO1的人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hep-2細(xì)胞由筆者構(gòu)建;MTT檢測試劑盒、DMSO、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清和PBS粉劑購自美國Sigma公司;流式細(xì)胞儀購自德國Heraeus公司，YG-875型超凈工作臺購自美國Bio-Rad公司，倒置光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用MTT法測定Hep-2細(xì)胞的增殖。以穩(wěn)定高表達(dá)ANO1的人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2作為實(shí)驗(yàn)組，空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hep-2細(xì)胞作為對照組，取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0．25%胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，然后接種到96孔板內(nèi)，使每孔細(xì)胞數(shù)為2000，每24 h檢測1次，共9 d，檢測前于每孔內(nèi)加入MTT(5 mg/ml)10 μl，放入CO2孵箱中孵育4 h，去上清，每孔加入異丙醇與0．04 mol/L鹽酸的混合物150 μl，震蕩1 h后，再利用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長處比色，每次檢測至少6孔，最后取其平均值。

細(xì)胞伸展實(shí)驗(yàn)采用4株穩(wěn)定高表達(dá)ANO1的人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2作為實(shí)驗(yàn)組，3株空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hep-2細(xì)胞作為對照組 (細(xì)胞剝脫實(shí)驗(yàn)和體外劃痕愈合實(shí)驗(yàn)分組情況同上)，將單細(xì)胞懸液接種到6孔板內(nèi)，每孔106個(gè)細(xì)胞，用1個(gè)倒置顯微鏡每30 min收集1次圖像，2 h后計(jì)數(shù)伸展和未伸展細(xì)胞，最后算出細(xì)胞伸展百分比。細(xì)胞伸展百分比=伸展細(xì)胞數(shù)/(未伸展細(xì)胞數(shù)+伸展細(xì)胞數(shù)) ×100%，每株細(xì)胞的伸展實(shí)驗(yàn)均被重復(fù)3次。

細(xì)胞剝脫實(shí)驗(yàn)將單細(xì)胞懸液接種到6孔板內(nèi)，每孔106個(gè)細(xì)胞，孵育2 d后，用0．02%胰蛋白酶在常溫下消化10 min，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，收集剝脫的細(xì)胞，然后計(jì)數(shù)剝脫和黏附細(xì)胞，最后算出細(xì)胞剝脫百分比。細(xì)胞剝脫百分比=剝脫細(xì)胞數(shù)/(未剝脫細(xì)胞數(shù)+剝脫細(xì)胞數(shù)) ×100%，每種細(xì)胞的剝脫實(shí)驗(yàn)均被重復(fù)3次。

Boyden小室侵襲試驗(yàn)將Boyden小室放入每孔加有500 μl含10%胎牛血清的6孔培養(yǎng)基中，Boyden小室中加入500 μl含10%胎牛血清，取各組細(xì)胞密度為4×105/ml的懸液200 μl加入Boyden小室，37℃孵育4 h。然后取出Boyden小室，將Boyden小室倒置，濾膜下層向上，PBS洗滌，3%戊二醛固定，染色，用棉花棒擦凈小室濾膜上層未侵襲的細(xì)胞。最后使用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照。以穿膜細(xì)胞百分比表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

體外劃痕愈合實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞重復(fù)接種于2個(gè)24孔板，待細(xì)胞長滿孔底，用200 μl的一次性塑料吸頭在孔底做劃痕，每孔內(nèi)均加入5 μmol/L阿非迪霉素，以阻止細(xì)胞分裂增殖。在32 h內(nèi)，用1個(gè)倒置顯微鏡收集圖像，放大倍率 ×40，利用Adobe Photosho PCS2測量劃痕兩側(cè)邊緣之間的距離和面積，劃痕面積百分比=現(xiàn)劃痕面積/始劃痕面積×100%。細(xì)胞遷移速度=(始劃痕兩側(cè)邊緣之間的距離-現(xiàn)劃痕兩側(cè)邊緣之間的距離)/時(shí)間 (μm/min)。

尼氟滅酸阻斷氯離子通道實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期穩(wěn)定高表達(dá)ANO1的人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞，將細(xì)胞重復(fù)接種于2個(gè)24孔板，待細(xì)胞長滿孔底，用200 μl的一次性塑料吸頭在孔底做劃痕，每孔內(nèi)均加入5 μmol/L阿非迪霉素。并在一個(gè)24孔板內(nèi)每孔加入100 μmol/L尼氟滅酸 (氯離子通道阻斷劑)作為實(shí)驗(yàn)組，另一個(gè)板內(nèi)每孔加入尼氟滅酸溶劑0．1%DSMO作為對照組。觀察方法和指標(biāo)同體外劃痕愈合實(shí)驗(yàn)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10．0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和尼氟滅酸阻斷氯離子通道實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用方差分析，細(xì)胞伸展實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞剝脫實(shí)驗(yàn)和Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用t檢驗(yàn)，體外劃痕愈合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用秩和檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組與對照組的細(xì)胞增殖情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=0．27，P=0．62)(表1)。

細(xì)胞伸展實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組伸展細(xì)胞百分比分別為 (42±18)%、(50±12)%、(82±9)%和 (75±10)%，對照組分別為 (36±6)%、(21±7)%和(33±6)%，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=39．97，P ＜0．0001)(圖1)。

圖1 培養(yǎng)90 min后ANO1過表達(dá)對Hep-2細(xì)胞伸展的影響(×400)Fig 1 Effect of ANO1 overexpression on cell spreading of Hep-2 cells after 90 min(×400)

細(xì)胞剝脫實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組剝脫細(xì)胞百分比分別為 (92．0 ±1．0)%、(85．0 ±2．0)%、(80．0 ±1．0)%和 (91．0±2．0)%，對照組分別為 (36．0 ±5．0)%、(39．0 ±0．2)% 和 (36．0 ± 1．0)%，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=62．34，P ＜0．0001)(圖2)。

Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組穿過濾膜的細(xì)胞百分比為 (54±5)%，是對照組 ［(26±1)%］的2倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=16．22，P＜0．0001)。

體外劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果32 h后，實(shí)驗(yàn)組劃痕面積百分比為0，明顯低于對照組的30%(F=39．89，P＜0．0001); 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞平均遷移速度為 (0．16±0．03)μm/min，明顯高于對照組的 (0．12 ±0．02) μm/min(t=4．84，P=0．0007)(表2、圖3)。

尼氟滅酸阻斷氯離子通道實(shí)驗(yàn)結(jié)果32 h后，對照組劃痕面積百分比為0，明顯低于實(shí)驗(yàn)組的20%(F=155．97，P＜0．0001);對照組細(xì)胞的平均遷移速度為 (0．16±0．03) μm/min，明顯高于實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的(0．12 ±0．02) μm/min(t=4．76，P=0．0009) (表3、圖4)。

圖2 ANO1過表達(dá)對Hep-2細(xì)胞剝脫的影響 (×100)Fig 2 Effect of ANO1 overexpression on cell detachment of Hep-2 cells(×100)

表1 ANO1過表達(dá)對Hep-2細(xì)胞增殖的影響Table 1 Effect of ANO1 overexpression on Hep-2

表2 ANO1過表達(dá)對Hep-2細(xì)胞遷移的影響 (%)Table 2 Effect of ANO1 overexpression on cell migration of Hep-2 cells(%)

表3 尼氟滅酸對Hep-2細(xì)胞遷移的影響 (%)Table 3 Effect of niflumic acid on cell migration of Hep-2 cells(%)

圖3 ANO1過表達(dá)對Hep-2細(xì)胞遷移的影響 (×40)Fig 3 Effect of ANO1 overexpression on cell migration of Hep-2 cells(×40)

圖4 尼氟滅酸對Hep-2細(xì)胞遷移的影響 (×40)Fig 4 Effect of niflumic acid on cell migration of Hep-2 cells(×40)

討 論

已知ANO1屬膜蛋白，具有8個(gè)穿膜片段，在ANO1的2個(gè)保守區(qū)域中，有1個(gè)區(qū)域參與有絲分裂。人ANO1包含26個(gè)外顯子，位于人11號染色體長臂1區(qū)3帶的 CCND1-EMS1基因座內(nèi)，編碼與C12orf 3、C11orf 25及FLJ34272基因產(chǎn)物同源的8-跨膜蛋白，11號染色體長臂1區(qū)3帶的基因是人類基因組中最常發(fā)生擴(kuò)增的基因之一。本研究以ANO1穩(wěn)定過表達(dá)的Hep-2細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)組，空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hep-2細(xì)胞作為對照組，檢測了細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果顯示，ANO1的高表達(dá)不會顯著影響細(xì)胞在指數(shù)增長階段的增殖，說明ANO1對于腫瘤的生長并沒有顯著的促進(jìn)作用。

已知腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的過程可分為以下幾個(gè)步驟：局部生長浸潤、從瘤體剝脫、遷移入血管或淋巴管、隨血液或淋巴循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移、遷移出血管或淋巴管、在新的部位伸展定居并生長增殖，可見瘤細(xì)胞的剝脫，遷移和伸展能力對腫瘤轉(zhuǎn)移是相當(dāng)重要的［3-4］。本研究采用Hep-2細(xì)胞株分別進(jìn)行了細(xì)胞剝脫實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞伸展實(shí)驗(yàn)、Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)和體外劃痕愈合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明ANO1高表達(dá)會促進(jìn)細(xì)胞剝脫、伸展和遷移，提示ANO1高表達(dá)可能是通過提高細(xì)胞的剝脫、伸展和遷移能力，最終促進(jìn)頭頸鱗癌的轉(zhuǎn)移。該結(jié)果與Ruiz［5］等研究結(jié)果一致，同時(shí)也驗(yàn)證了本研究的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

氯離子通道在細(xì)胞遷移過程中可發(fā)揮重要作用。在細(xì)胞頭部，通過Na+/H+和Cl-/HCO3-的交換，以及Na+-HCO3-的聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞頭部胞內(nèi)滲透壓變大，導(dǎo)致細(xì)胞頭部偽足的體積膨脹，向前移動，而逐漸膨脹的偽足還可導(dǎo)致細(xì)胞膜張力變大，從而激發(fā)細(xì)胞尾部鈣離子通道的開放，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，誘發(fā)氯離子外流，細(xì)胞尾部胞內(nèi)滲透壓降低，致使細(xì)胞尾部體積回縮，最終完成細(xì)胞整體向前移動。2008年，Schroeder等［6］、Caputo 等［7］和 Yang 等［8］分別發(fā)表了關(guān)于利用膜片鉗法證明ANO1具有需鈣離子激活的氯離子通道活性的論文，這一發(fā)現(xiàn)為ANO1與癌癥的研究提出了新方向，即ANO1離子通道活性是否參與了癌細(xì)胞的遷移。本研究采用尼氟滅酸阻斷氯離子通道，結(jié)果表明細(xì)胞的遷移變慢，充分說明ANO1需鈣離子激活的氯離子通道活性參與了細(xì)胞的遷移運(yùn)動。當(dāng)ANO1高表達(dá)，細(xì)胞膜上的鈣離子和氯離子通道增多，鈣離子和氯離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)會增多，從而導(dǎo)致胞內(nèi)滲透壓的節(jié)律變化加快，促進(jìn)了細(xì)胞的遷移。目前已有多項(xiàng)研究證實(shí)氯離子通道在腫瘤細(xì)胞的遷移過程中發(fā)揮了重要的作用［9-14］，而阻斷離子通道，有時(shí)會帶來意想不到的療效［15］，目前氯離子通道屬尚未開發(fā)的藥物靶點(diǎn)，其抑制劑正在研究開發(fā)之中［16］。

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Effects of Membrane Protein ANO1 Stable Overexpression on Laryngocarcinoma Hep-2 Cells

LI Ya-dong

Department of Oral and Maxillofacial Surgery，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

Tel：023-89012907，E-mail：llxxyydd2006@sina．com

ObjectiveTo explore the effects of ANO1 overexpression on the proliferation，detachment，spreading，and migration of laryngocarcinoma Hep-2 cell line．MethodsANO1-overexpressing Hep-2 cell line was selected as the assay group，and Hep-2 cell line with empty plasmid was selected as the control group．MTT assay was used to detect the proliferation abilities of Hep-2 cells in both two groups．Cell detachment assay and spreading assay were used to detect the detachment and spreading abilities of Hep-2 cells．Boyden chamber invasion assay，wound healing assay in vitro，and niflumic acid block chloride channel were used to detect the migration abilities of Hep-2 cells．All data were analyzed by SPSS 10．0 software package．ResultsCell proliferationassay by MTT showed that，compared with the control group，the optical density value of assay group was not significantly different(P=0．62) ．The results of cell detachment assay and cell spreading assay showed the cell detachment rates and cell spreading rates in assay group were significantly higher than those in control group(P＜0．0001) ．The results of Boyden chamber invasion assay showed the percentages of cells migrating through the membrane in assay group were significantly higher than those in control group(P ＜0．0001) ．The results of in vitro wound healing experiments showed the wound area rate in assay group was significantly lower than that in control group(P ＜ 0．0001) ．The results of niflumic acid blocking chloride channel experiments showed the wound area rates in assay group were significantly higher than those in control group(P ＜0．0001) ．Conclusion ANO1 overexpression does not remarkably alter the proliferation rate of cancer cells，but increases the migration，spreading，and detachment capacities of head and neck squamous cell carcinoma．

head and neck squamous cancer;chloride channel;metastasis

R782．2

A

1000-503X(2014)01-0020-05

10．3881/j．issn．1000-503X．2014．01．004

重慶市自然科學(xué)基金 (cstc2012jjA10039)、重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目 (2011-2-013)和重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目 (KJ130318)Supported by the Natural Science Foundation Project of CQ CSTC(cstc2012jjA10039)，the Medical Research Project of Chongqing Municipal Health Bureau(2011-2-013)，and the Science and Technology Research Project of Chongqing Municipal Commission of Education(KJ130318)

2013-10-23)