, , ,,,3，*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040； 2.黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院,黑龍江哈爾濱 150020； 3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150090)

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取紅皮云杉多酚工藝

周芳1,2,趙鑫1,宮婕1,劉海鵬1,王振宇1,3，*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040； 2.黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院,黑龍江哈爾濱 150020； 3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150090)

采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取紅皮云杉多酚工藝。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇料液比、超聲波功率、提取時(shí)間為自變量,以多酚得率為響應(yīng)值,采用Box-Benhnken法設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,回歸模型擬合度高,最佳工藝條件為：料液比1∶33、超聲波功率301W、提取時(shí)間2.4h,乙醇濃度40%,溫度60℃。在此條件下,紅皮云杉多酚的得率為18.92%。

紅皮云杉,多酚,超聲波,響應(yīng)面

紅皮云杉(PiceakoraiensisNakai)是松科云杉屬常綠喬木,分布于大、小興安嶺、完達(dá)山及張廣才嶺,吉林長白山等地。松科植物中含有萜類、多酚類、生物堿等多種生物活性成分[l],具有抗氧化、抗病毒及抗菌等生物活性[2-3]。植物多酚,習(xí)慣稱單寧或鞣質(zhì),廣泛存在于植物體的葉、木、皮、殼和果肉中,許多針葉樹皮中植物多酚含量高達(dá)20%～40%[4]。植物多酚作為一類儲(chǔ)存豐富可再生的綠色資源,可作為高附加值的精細(xì)化工原料,隨著許多新用途的發(fā)現(xiàn),尤其是許多新型的醫(yī)藥,農(nóng)藥以此為原料,因此國內(nèi)外需求量逐年上升,目前已成為國內(nèi)熱點(diǎn)的精細(xì)化工原料[5]。超聲波可產(chǎn)生機(jī)械破碎和空化作用,使細(xì)胞破碎,加速浸提物從原料向溶劑的擴(kuò)散,與傳統(tǒng)浸提法相比,具有提取效率高、溫度低、能耗低、提取時(shí)間短等特點(diǎn)[6-7]。本文采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取紅皮云杉多酚的工藝,旨在為紅皮云杉的深入研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

紅皮云杉球果 采自長白山；無水乙醇、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯 天津市富宇精細(xì)化工有限公司,無水碳酸鈉 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；沒食子酸 SIGMA公司；福林酚試劑 天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑；所用化學(xué)試劑均為分析純。

高速萬能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器公司；T6紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用公司；KQ-500DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；NDJ-1電熱恒溫水浴鍋 北京醫(yī)療電子儀器廠；電子天平 上海精天電子儀器廠；TDL-5臺(tái)式離心機(jī) 上?？婆d儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多酚提取工藝過程 紅皮云杉球果→干燥→粉碎(40目)→除脂→干燥→超聲輔助提取→離心→取上清液→定容并測(cè)量吸光度→計(jì)算多酚得率

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別準(zhǔn)確量取沒食子酸標(biāo)樣(材料中沒有列出)溶液(100μg/mL)0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35mL于10mL比色管中,加蒸餾水至2mL,搖勻后加入1.0mL福林酚(材料中沒有列出)試劑,4min后加入1.0mL 10%的碳酸鈉溶液,25℃水浴下保持2h后,在765nm處測(cè)定吸光度值,得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.0214x+0.0033,R2=0.9992。

1.2.3 紅皮云杉多酚得率的測(cè)定 準(zhǔn)確吸取1mL紅皮云杉球果提取液于10mL比色管中,加蒸餾水至總體積為2mL。加入1.0mL福林酚試劑后搖勻,4min后加入1.0mL 10%碳酸鈉溶液,25℃水浴下保持2h后,在765nm處測(cè)定吸光度值。將吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算樣品中多酚的得率。

式中：Y-多酚得率(%),A-吸光值,b-標(biāo)準(zhǔn)曲線截距,N-稀釋倍數(shù),V-溶劑體積(mL),a-標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率,M-紅皮云杉球果粉末質(zhì)量(g)。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 通過單因素實(shí)驗(yàn),分別考察料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、超聲波功率對(duì)紅皮云杉多酚得率的影響。

1.2.4.1 料液比對(duì)多酚得率的影響 精確稱取6份2.00g的紅皮云杉球果粉末,在乙醇濃度為40%、超聲波功率為250W、提取溫度為50℃、提取時(shí)間為2h的條件下,料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60。

1.2.4.2 乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響 精確稱取6份2.00g的紅皮云杉球果粉末,在料液比為1∶20、超聲波功率為250W、提取溫度為50℃、提取時(shí)間為2h的條件下,乙醇濃度分別為0%、20%、40%、60%、80%、100%。

1.2.4.3 提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響 精確稱取6份2.00g的紅皮云杉球果粉末,在料液比為1∶20、乙醇濃度為40%、超聲波功率為250W、提取溫度為50℃的條件下,提取時(shí)間分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5h。

1.2.4.4 提取溫度對(duì)多酚得率的影響 精確稱取6份2.00g的紅皮云杉球果粉末,在料液比為1∶20、乙醇濃度為40%、超聲波功率為250W、提取時(shí)間為2h的條件下,提取溫度分別為30、40、50、60、70、80℃。

1.2.4.5 超聲波功率對(duì)多酚得率的影響 精確稱取6份2.00g的紅皮云杉球果粉末,在料液比為1∶20、乙醇濃度為40%、提取溫度為50℃、提取時(shí)間為2h的條件下,超聲波功率分別為200、250、300、350、400、450W。

1.2.5 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以料液比、超聲功率、超聲時(shí)間三個(gè)因素為自變量,以多酚得率為響應(yīng)值,采用Box-Behnken設(shè)計(jì)法優(yōu)化多酚提取工藝條件,分析軟件為Statistica 6.0。設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)分析實(shí)驗(yàn),中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次,實(shí)驗(yàn)的因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平表

2 結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)多酚得率的影響 由圖1可知,在料液比在1∶10～1∶30時(shí),隨料液比的增加,多酚得率也增加,且基本呈正相關(guān)關(guān)系,在料液比為1∶30時(shí),多酚得率最高；在料液比為1∶30～1∶60時(shí),隨料液比的增加,多酚得率有所下降。由增加濃度梯度可增加提取效果[8],因而提高料液比有利于多酚的提取,但當(dāng)料液比達(dá)到某一限度時(shí),再提高料液比則相當(dāng)于對(duì)多酚溶液的稀釋,降低了濃度梯度,同時(shí),更多的溶劑也可能消耗了超聲波的能量,所以多酚得率反而有所下降。因此,選擇料液比為1∶30左右進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖1 料液比對(duì)多酚得率的影響

2.1.2 乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響 乙醇具有浸提選擇性好、對(duì)植物細(xì)胞的穿透能力強(qiáng)、浸出率高、提取時(shí)間短、溶解出的雜質(zhì)少、提取物不易霉變、且毒性小等優(yōu)點(diǎn)[9]。由圖2可知,在乙醇濃度為0～40%時(shí),隨著乙醇濃度的增加,多酚得率隨之增加,且基本呈正相關(guān)關(guān)系,乙醇濃度為40%,多酚得率最高；繼續(xù)增加乙醇濃度,多酚得率明顯下降,這可能是因?yàn)橐掖紳舛葹?0%時(shí),與紅皮云杉多酚的極性最為相近,多酚的溶解度最大。因此,最終選擇乙醇濃度為40%。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響 由圖3可知,在提取時(shí)間為0.5～1h時(shí),隨著提取時(shí)間的增加,多酚得率明顯增加,且基本呈正相關(guān)關(guān)系；在提取時(shí)間為1～2h時(shí),多酚得率增加較緩,在2h時(shí),多酚得率已達(dá)到較高水平；在提取時(shí)間為2～3h時(shí),多酚得率增加不明顯,多酚的提取量已經(jīng)達(dá)到飽和。因此,選擇提取時(shí)間為2h左右進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖2 乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

2.1.4 提取溫度對(duì)多酚得率的影響 由圖4可知,在提取溫度為30～60℃時(shí),隨著提取溫度的增加,多酚得率明顯增加,且基本呈正相關(guān)關(guān)系,提取溫度為60℃,多酚得率最高；在提取溫度為60～80℃時(shí),多酚得率有所下降。多酚中含有大量的酚羥基,化學(xué)性質(zhì)比較活潑,在一定的溫度范圍內(nèi),提高溫度有利于多酚的提取,但是在較高的溫度下,多酚會(huì)變得很不穩(wěn)定。Antolovich[10]的研究也發(fā)現(xiàn),當(dāng)溫度達(dá)到60℃后,多酚的提取量顯著下降。因此,最終選擇提取溫度為60℃。

圖4 提取溫度對(duì)多酚得率的影響

2.1.5 超聲波功率對(duì)多酚得率的影響 由圖5可知,在超聲波功率為200～300W時(shí),隨著超聲波功率的增加,多酚得率明顯增加,且基本呈正相關(guān)關(guān)系,在超聲波功率為300W時(shí),多酚得率最高；在超聲波功率為300～450W時(shí),多酚得率明顯下降,且基本呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。隨著超聲波功率的增加,在單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的空化作用增多,熱效應(yīng)增大,出現(xiàn)更為明顯的湍動(dòng)效應(yīng)和局部微攪動(dòng)效應(yīng),有利于多酚的提取,但是在功率超過300W后,過高的聲強(qiáng)使溶液溫度升高過快,多酚有所損失,反而不利于多酚的提取。因此,選擇超聲波功率為300W左右進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖5 超聲波功率對(duì)多酚得率的影響

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇料液比、超聲波功率、提取時(shí)間3個(gè)因素,進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 數(shù)學(xué)模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,方差分析結(jié)果見表3,得到的回歸模型為：

Y=18.744+0.675X1-0.095X2+0.575X3-0.025X1X2-0.045X1X3+0.09X2X3-1.182X12-0.477X22-0.317X32

由表3可知,回歸模型的顯著性水平p<0.0001,達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)p=0.556>0.05,影響不顯著,且相關(guān)系數(shù)R2=0.9954,表明實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值高度相關(guān)。綜上所述,建立的回歸模型擬合度高,可用該模型較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。因此,可用該模型預(yù)測(cè)紅皮云杉多酚的提取工藝條件。

表3 回歸模型方差分析

注：*表示差異顯著(p<0.05),**表示差異極顯著(p<0.01)。

回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表4。t檢驗(yàn)結(jié)果表明,料液比、提取時(shí)間的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)、超聲波功率的二次項(xiàng)對(duì)多酚得率的影響極顯著,超聲波功率的一次項(xiàng)對(duì)多酚得率的影響顯著,而交互項(xiàng)對(duì)多酚得率的影響不顯著。各因素對(duì)多酚得率影響程度大小順序?yàn)椋毫弦罕?提取時(shí)間>超聲波功率。

表4 回歸模型顯著性檢驗(yàn)

注：*表示差異顯著(p<0.05),**表示差異極顯著(p<0.01)。

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 利用Statistica 6.0軟件,繪制各因素對(duì)紅皮云杉多酚得率影響的響應(yīng)曲面圖,結(jié)果見圖6～圖8。如果一個(gè)響應(yīng)曲面的坡度較平緩,表明隨著處理?xiàng)l件的變化,響應(yīng)值變化較??；而如果一個(gè)響應(yīng)曲面的坡度較陡峭,表明隨著處理?xiàng)l件的變化,響應(yīng)值變化較大。

由圖6可知,響應(yīng)面的坡度較陡,表明料液比與超聲波功率的交互作用對(duì)多酚得率有較大影響,從等高線的疏密度可以判斷出,料液比對(duì)響應(yīng)值的影響大于超聲波功率。

圖6 料液比和超聲波功率對(duì)多酚得率影響的響應(yīng)面圖

圖7 料液比和提取時(shí)間對(duì)多酚得率影響的響應(yīng)面圖

圖8 超聲波功率和提取時(shí)間對(duì)多酚得率影響的響應(yīng)面圖

由圖7可知,響應(yīng)面的坡度也較陡,表明料液比與提取時(shí)間的交互作用對(duì)多酚得率有較大影響,從等高線的疏密度可以判斷出,料液比對(duì)響應(yīng)值的影響大于提取時(shí)間。

由圖8可知,響應(yīng)面的坡度較平緩,表明超聲波功率與提取時(shí)間的交互作用對(duì)多酚得率的影響較小,從等高線的疏密度可以判斷出,提取時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響大于超聲波功率。

綜上所述,料液比對(duì)多酚得率的影響最大,提取時(shí)間次之,超聲波功率的影響較小。通過計(jì)算,得到的最佳工藝條件為：料液比為1∶32.69、超聲波功率為301.16W、提取時(shí)間為2.44h。在此條件下,紅皮云杉多酚的得率為19.09%?？紤]到實(shí)際操作條件,將條件修正為料液比1∶33、超聲波功率301W、提取時(shí)間2.4h。在此條件下,進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),實(shí)際測(cè)得的得率為18.92%,實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差<1%,說明回歸模型擬合度高,可用于優(yōu)化紅皮云杉多酚的提取工藝條件,具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面分析法對(duì)紅皮云杉多酚的提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,料液比、超聲波功率、提取時(shí)間對(duì)紅皮云杉多酚得率均有顯著影響,最佳工藝條件為：料液比1∶33、超聲波功率301W、提取時(shí)間2.4h,乙醇濃度40%,溫度60℃。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,紅皮云杉多酚的得率為18.92%,回歸模型擬合度高,可用于優(yōu)化紅皮云杉多酚的提取工藝條件,具有實(shí)用價(jià)值。

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Optimization of ultrasonic-assisted extraction conditions of polyphenol fromPiceakoraiensisNakaiby response surface methodology

ZHOUFang1,2,ZHAOXin1,GONGJie1,LIUHai-peng1,WANGZhen-yu1,3，*

(1. School of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China; 2. The Academy of Quality Inspection and Research in Hei Long Jiang Province,Harbin 150020,China； 3. School of Food Science and Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China)

The ultrasonic-assisted extraction conditions of polyphenol fromPiceakoraiensiswere optimized by response surface methodology. Based on single factor test,a 3-factor,3-level Box-Behnken experimental was adopted,including dependent variables(ratio of material to liquid,ultrasonic wave power and extraction time)and independent variable(yield of polyphenols). The results showed that the regression model fit well with experimental data. The optimum conditions were ratio of material to liquid 1∶33,ultrasonic wave power 301W,extraction time 2.4h,ethanol concentration 40%,extraction temperature 60℃. Under these conditions,the yield of polyphenol was 18.92%.

PiceakoraiensisNaka;polyphenol;ultrasonic wave;response surface methodology

2013-06-17 *通訊聯(lián)系人

周芳 (1981-),女,博士,工程師,研究方向：植物資源開發(fā)及植物活性成分研究。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31170510)。

TS201.1

：B

：1002-0306(2014)01-0210-05