張良勝等

[摘要] 目的 探索成年SD大鼠心室肌細胞急性酶分離及記錄瞬時外向鉀電流的方法。 方法 以成年SD大鼠為研究對象，利用Langendorff灌流系統(tǒng)，利用Ⅱ型膠原酶二步灌流方法分離細胞，利用膜片鉗技術(shù)記錄大鼠心室肌瞬時外向鉀電流。 結(jié)果 鏡下可見存活心肌：呈桿狀或矩形，表面干凈，橫紋清晰，立體感強，能記錄出瞬時外向鉀電流達3000 pA。 結(jié)論 本實驗所用的方法細胞成活率高，能記錄出瞬時外向鉀電流。

[關(guān)鍵詞] 心肌細胞；瞬時外向鉀電流；膜片鉗技術(shù)

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）08（a）-0020-03

Separation of acute enzyme of ventricular myocyte and record of transient outward potassium current in rats

ZHANG Liang-sheng1 LI Ping1 XU Xiang1 WANG Li1 FAN Zhong-cai2

1.Department of Cardiology，People′s Hospital of Yongzhou City in Henan Privince，Yongzhou 476600，China；2.Department of Cardiology，Affliated Hospital of Luzhou Medical College， Luzhou 646000，China

[Abstract] Objective To explore the method of acute isolate of separation of acute enzyme of ventricular myocyte and recording transient outward potassium current in adult SD rats. Methods Adult SD rats were selected as subjects， Langendorff perfusion system and type Ⅱ collagenase two step perfusion method were used to separate cell， and pacth clamp technique was used to record transient outward potassium current of ventricular myocyte in rats. Results The viable myocardium was seen Microscopically：it is lod or a rectangle，the surface is clean with clear cross striations and strong three-dimensional senseand it can record the transient outward potassium current up to 3000 pA. Conclusion Survival rate of cell of the method applied in the experiment and transient outward potassium current can be recorded.

[Key words] Myocardial cell；Transient outward potassium current；Pacth clamp technique

成年大鼠心肌細胞的分離方法步驟比較復(fù)雜，條件要求很高，影響因素較多，不易獲得高質(zhì)量的心肌細胞，心肌細胞酶分離是難點，是膜片鉗實驗記錄電流的基礎(chǔ)。40多年來，酶解法被用于成年大鼠的心肌分離，到目前為止，尚無統(tǒng)一方法可循[1-2]，本實驗采用兩步酶解法分離出較好形態(tài)的心肌細胞，并且能記錄到瞬時外向鉀電流。

1 材料與方法

1.1實驗動物

SD大鼠，清潔級，體重180～220 g，購于第三軍醫(yī)大學醫(yī)學實驗動物中心，試驗中對動物處置符合倫理學標準。

1.2 藥品與試劑

氯化鈷（CoCl2），乙二醇雙四乙酸（EGTA），血清白蛋白（albumin），羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），?；撬幔╰aurine），膠原酶Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Worthington），谷氨酸（glutamic acid），天冬氨酸鉀（K-aspartate）均為Sigma公司產(chǎn)品，其余為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3溶液配制

心肌細胞分離又一影響因素是溫度。放置心臟于4℃無鈣臺液中，能降低心肌氧耗量，保護心肌。25～30℃室溫下進行心肌細胞分離，灌流液溫度37～38℃[10]。由于恒溫裝散熱，應(yīng)測量心臟懸掛端流出液溫度，據(jù)流出液溫度調(diào)整恒溫水浴的溫度。文獻報道細胞可在常溫下靜置保存，也可在37℃二氧化碳卵浮箱內(nèi)保存[11]。在本實驗中細胞存放在4℃冰箱內(nèi)，這樣細胞代謝降低，氧耗量降低，細胞保存時間會延長。

以往國內(nèi)外常采用Langendorff四步酶解法來分離心肌細胞[2]?，F(xiàn)在大多采用兩步酶解法：①無鈣臺液灌流；②酶液灌流。本實驗在龍毅[12-13]等報道的急性酶分離大鼠心房肌細胞方法的改進基礎(chǔ)上操作，縮短心臟灌流的時間，減輕心肌缺血、缺氧時間，有利保存心肌細胞[14]。第一步灌流時間盡量在5 min內(nèi)，只要心臟流出液為清亮色，心臟停止跳動即停止灌流。第二步酶液灌流：酶作用的強弱不同和種類不同，灌流速度不同，灌流的時間也不同。本實驗灌流速度為8 ml/min，消化時間為6～15 min。消化開始時心臟呈紅褐色，質(zhì)軟，酶解過程中心臟體積增大，發(fā)白變硬，后期腫脹發(fā)白塌陷。換酶液6 min后，每隔1分鐘取1小塊左心室組織，共取10次，可獲得穩(wěn)定且質(zhì)量高的心肌細胞。

文獻報道處死大鼠方式有非麻醉法與麻醉法。多采用麻醉方法取心臟，麻醉可快速取心臟，縮短了懸掛心臟時間。若采用棒擊法或者斷頸法取心臟，操作者要非常熟練，熟練程度不夠會影響心肌細胞的獲得取。麻醉過深導致呼吸抑制，心肌細胞的獲得也會受影響。

鈣反常指無鈣溶液中分離的細胞當再次進入生理濃度鈣溶液中，細胞會不停地收縮，漸漸變圓，失去原來有序結(jié)構(gòu)和收縮功能直至溶解[15]。減少鈣反常的方法是改進實驗方法，完善實驗條件，提高心肌細胞質(zhì)量，要求熟練操作，適當實驗條件控制。本方法分離的心肌細胞能耐鈣，成活率高。

注意整個操作過程中充氧，各種灌流液不能有氣泡，氣泡可堵塞冠狀動脈，常規(guī)肝素化抗凝防血塊堵塞冠狀動脈，所有的操作都要熟練。

[參考文獻]

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[10] 張華，劉惠亮，楊勝利，等.缺氧-復(fù)氧誘導人肥大心肌細胞凋亡信號的變化[J].醫(yī)學研究生學報，2009，22（1）：12-15.

[11] 張軍，宋俊麗，武冬梅.膜片鉗實驗中心肌細胞快速分離方法分析[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6（10）：1238-9.

[12] 龍毅，周亞南，殷躍輝.急性分離大鼠心房肌細胞方法的改進及對鉀、鈉、 鈣電流的記錄[J].重慶醫(yī)科大學學報，2011，36（8）：910-912.

[13] 王騰，唐其栓，甘文云，等.大鼠心肌細胞的分離技術(shù)及電生理鑒定[J].科技導報，2009，27（3）：80-84.

[14] Wijffels MC，Kirchhof CJ，Dorland R，et al.Atrial fibrillation begets atrial fibrillation.A study in awake chronically instrumented goats[J].Circulation，1995，92（7）：1954-1968.

[15] Gallego M，Setien R，Puebla L.et al.Alpha1-Adrenoceptors stimulate a Galphas protein and reduce the ansient outward K+ current via a cAMP/PKA mediated pathway in the rat heart[J].Am J Physiol Cell Physiol，2005，288（3）：C577-C585.

（收稿日期：2014-05-21 本文編輯：許俊琴）

文獻報道處死大鼠方式有非麻醉法與麻醉法。多采用麻醉方法取心臟，麻醉可快速取心臟，縮短了懸掛心臟時間。若采用棒擊法或者斷頸法取心臟，操作者要非常熟練，熟練程度不夠會影響心肌細胞的獲得取。麻醉過深導致呼吸抑制，心肌細胞的獲得也會受影響。

鈣反常指無鈣溶液中分離的細胞當再次進入生理濃度鈣溶液中，細胞會不停地收縮，漸漸變圓，失去原來有序結(jié)構(gòu)和收縮功能直至溶解[15]。減少鈣反常的方法是改進實驗方法，完善實驗條件，提高心肌細胞質(zhì)量，要求熟練操作，適當實驗條件控制。本方法分離的心肌細胞能耐鈣，成活率高。

注意整個操作過程中充氧，各種灌流液不能有氣泡，氣泡可堵塞冠狀動脈，常規(guī)肝素化抗凝防血塊堵塞冠狀動脈，所有的操作都要熟練。

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（收稿日期：2014-05-21 本文編輯：許俊琴）

文獻報道處死大鼠方式有非麻醉法與麻醉法。多采用麻醉方法取心臟，麻醉可快速取心臟，縮短了懸掛心臟時間。若采用棒擊法或者斷頸法取心臟，操作者要非常熟練，熟練程度不夠會影響心肌細胞的獲得取。麻醉過深導致呼吸抑制，心肌細胞的獲得也會受影響。

鈣反常指無鈣溶液中分離的細胞當再次進入生理濃度鈣溶液中，細胞會不停地收縮，漸漸變圓，失去原來有序結(jié)構(gòu)和收縮功能直至溶解[15]。減少鈣反常的方法是改進實驗方法，完善實驗條件，提高心肌細胞質(zhì)量，要求熟練操作，適當實驗條件控制。本方法分離的心肌細胞能耐鈣，成活率高。

注意整個操作過程中充氧，各種灌流液不能有氣泡，氣泡可堵塞冠狀動脈，常規(guī)肝素化抗凝防血塊堵塞冠狀動脈，所有的操作都要熟練。

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[12] 龍毅，周亞南，殷躍輝.急性分離大鼠心房肌細胞方法的改進及對鉀、鈉、 鈣電流的記錄[J].重慶醫(yī)科大學學報，2011，36（8）：910-912.

[13] 王騰，唐其栓，甘文云，等.大鼠心肌細胞的分離技術(shù)及電生理鑒定[J].科技導報，2009，27（3）：80-84.

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[15] Gallego M，Setien R，Puebla L.et al.Alpha1-Adrenoceptors stimulate a Galphas protein and reduce the ansient outward K+ current via a cAMP/PKA mediated pathway in the rat heart[J].Am J Physiol Cell Physiol，2005，288（3）：C577-C585.

（收稿日期：2014-05-21 本文編輯：許俊琴）