顏培實(shí)+段麗欽+畢莎莎+王曉旭

[摘要]目的 探討環(huán)孢霉素A（CSA）對小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）向心肌細(xì)胞分化的影響及調(diào)控機(jī)制。方法 應(yīng)用分階段胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化系統(tǒng)，設(shè)ESCs自發(fā)組和CSA誘導(dǎo)組，用細(xì)胞免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞儀（FACS）評估心肌細(xì)胞分化率以及計數(shù)。細(xì)胞免疫化學(xué)檢測CSA誘導(dǎo)出的心肌細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。在ES細(xì)胞分化的不同階段添加CSA，觀察CSA是否特異地作用于某一特定的分化階段。分別添加另外一種免疫抑制劑也是鈣調(diào)磷酸酶抑制劑他克莫司（FK506）和T細(xì)胞核因子（NFAT）抑制劑11R-VIVIT，與添加CSA比較，比較各組的心肌細(xì)胞分化率。結(jié)果 ESCs自發(fā)組的心肌細(xì)胞分化率為（6.00±0.05）%，CSA誘導(dǎo)組為（60.00±0.08）%，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且誘導(dǎo)生成的心肌細(xì)胞具備心肌細(xì)胞特有的特征。CSA特異性地作用于中胚層干細(xì)胞，促進(jìn)其分化成心肌干細(xì)胞；CSA強(qiáng)力促進(jìn)中胚層干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞增多，相反分化成的上皮細(xì)胞減少；添加FK506和11R-VIVIT后沒有出現(xiàn)類似CSA的促心肌分化作用。結(jié)論 CSA特異地作用于中胚層干細(xì)胞，通過非NFAT徑路，能夠強(qiáng)力誘導(dǎo)ESCs向心肌細(xì)胞分化。

[關(guān)鍵詞]環(huán)孢霉素A；心肌干細(xì)胞；胚胎干細(xì)胞；心肌細(xì)胞；分化

[中圖分類號] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）09（a）-0004-04

Influence of Cyclosporine A on the differentiation of mouse embryonic stem cells into cardiomyocytes and its regulatory mechanism

YAN Pei-shi DUAN Li-qin BI Sha-sha WANG Xiao-xu

The First Department of Cardiology，Dalian Central Hospital in Liaoning Province，Dalian 116033，China

[Abstract]Objective To explore the influence of Cyclosporine-A （CSA） on the differentiation of mouse embryonic stem cells （ESCs） into cardiomyocytes and its mechanism of regulation.Methods The differentiation system of mouse embryonic stem cells into cardiomyocytes by stages was used，and ESCs spontaneous group and CSA induction group were designed.The differentiation rate and count of cardiomyocytes were evaluated by cell immunohistochemistry and flow cytometry （FACS）.The expression of CSA-induced cardiomyocyte markers was detected by cell immunohistochemistry.CSA was added at different stages of ES cell differentiation to observe whether CSA specifically acted on a particular differentiation phase.Another immunosuppressive agent including tacrolimus （calcineurin inhibitor：FK506） or 11R-VIVIT （nuclear factor of activated T cells：NFAT） was separately added in order to compare the differentiation rate of cardiomyocytes among the groups.Results In the ESCs spontaneous group，the differentiation rate of cardiomyocytes was （6.00±0.05）%，and the rate in the CSA-induction group was （60.00±0.08）%，which was displayed a statistical difference （P<0.05）.The cardiomyocytes generated from induction possessed the unique characteristics.CSA specifically acted on mesodermal stem cells and promoted the differentiation of these cells into cardiac stem cells.The amount of myocardial cells was increased differentiated from mesodermal stem cells strongly promoted by CSA，while the number into epithelial cells was in decrease.After adding FK506 and 11R-VIVIT，there was no similar effect of CSA on promotion of cardiomyocyte differentiation.Conclusion Cyclosporine-A specifically acts on mesodermal stem cells and can powerfully induce these ESCs into the differentiated cardiomyocytes via non-NFAT pathway.endprint

[Key words]Cyclosporine A；Cardiac stem cells；Embryonic stem cells；Cardiomyocytes；Differentiation

近年胚胎干細(xì)胞研究已證實(shí)胚胎干細(xì)胞能夠誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞，移植到體內(nèi)后可形成心肌組織，這無疑給心肌再生醫(yī)療帶來了新的希望和選擇[1-2]。但是移植心肌細(xì)胞的方法一直未完全建立，主要因?yàn)槟壳胺浅Ｓ行Ш吞禺惖卣T導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化擴(kuò)增方法有限，收集大量移植用的心肌細(xì)胞較困難[3]。

有研究報道了一個不同于傳統(tǒng)擬胚體的ESCs體外分化系統(tǒng)[4-5]，是一個二維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。內(nèi)皮細(xì)胞（血管上皮細(xì)胞）、血細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞能夠分別系統(tǒng)地從共同的中胚層干細(xì)胞誘導(dǎo)出來，即表達(dá)Flk1（也是血管內(nèi)皮生長因子受體2）的細(xì)胞。應(yīng)用這一分化系統(tǒng)還成功確定了Flk1+中胚層干細(xì)胞衍生的心肌干細(xì)胞群，即FCV細(xì)胞群（Flk1+/CXCR4+/血管上皮cadherin-）。

當(dāng)進(jìn)行細(xì)胞移植研究時，為觀察環(huán)孢霉素A（Cyclosporine-A，CSA）是否對供體細(xì)胞的分化和生長有影響，本研究應(yīng)用二維ESCs培養(yǎng)系統(tǒng)在體外檢測CSA對ESCs向心肌細(xì)胞分化的影響。

1試劑與方法

1.1 主要試劑

諾華公司贈送環(huán)孢霉素A（CSA），用二甲基亞砜溶解為30 mg/ml，用時使用培養(yǎng)液稀釋成1～3 μg/ml。Astellas 公司贈送FK506，用二甲基亞砜溶解為10 mg/ml，用時使用培養(yǎng)液稀釋成（10 ng～1 μg）/ml。11R-VIVIT從Calbiochem購買。小鼠E-cadhein Flk1單克隆抗體由日本京都大學(xué)贈送。小鼠CD31 和 biotinylated-CXCR4單克隆抗體從BD Pharmingen購買。多克隆兔GFP抗體從MBL購買。小鼠抗心肌肌小節(jié)抗體（α-actinin）從Sigma公司購買，單克隆抗肌鈣蛋白T（cTnT）抗體從NeoMarkers公司購買。

1.2方法

1.2.1鼠ESCs培養(yǎng)及分化 本研究使用EMG7胚胎干細(xì)胞株，因?qū)肓甩罬HC啟動子控制的GFP基因，所以當(dāng)分化的心肌細(xì)胞出現(xiàn)自主搏動時，可在熒光顯微鏡下觀察到心肌細(xì)胞的綠色熒光。胚體干細(xì)胞的培養(yǎng)方法同前[4]。單純加培養(yǎng)液的設(shè)為對照組（n=5）；培養(yǎng)液加入CSA（n=5），即CSA組，在Flk1陽性細(xì)胞接種到OP9細(xì)胞上時加入CSA。

1.2.2 OP-9細(xì)胞的準(zhǔn)備 培養(yǎng)方法同前[4]。

1.2.3流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞分化率和分離提純細(xì)胞后計數(shù) 經(jīng)過96～108 h的培養(yǎng)，消化收集細(xì)胞，加入APC-Flk1抗體后，用DAPI標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀分析Flk1分化率并將Flk1陽性細(xì)胞分離出來，繼續(xù)在OP9細(xì)胞上培養(yǎng)2 d，把細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化，收集起來，與PE-AVAS12和biotinylated-CXCR4抗體相繼結(jié)合，再與streptavidin-APC結(jié)合，用FACS-Vantage分析FCV陽性率并分離提純FCV陽性細(xì)胞；在OP9細(xì)胞上培養(yǎng)6 d，將收集的細(xì)胞與抗CD45或CD31抗體結(jié)合，用FACS分析血細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞和GFP陽性的心肌細(xì)胞。

1.2.4細(xì)胞免疫熒光檢測 吸掉培養(yǎng)液，4%多聚甲醛室溫固定15 min，冷PBS洗滌2次，加1%BSA室溫下封閉30 min。cTnT抗體（1∶2000稀釋），α-actinin（1∶200稀釋）4℃孵育過夜。翌日，PBS洗滌2次，Alexa546標(biāo)記的兔抗鼠抗體（1∶200稀釋）室溫孵育1 h；PBS洗滌后標(biāo)記0.1 μg/ml DAPI，最后在熒光顯微鏡下觀測。

1.2.5定量分析心肌細(xì)胞的分化率 cTnT的熒光強(qiáng)度使用電子CCD相機(jī)探測，數(shù)據(jù)用Image-Pro Plus圖像處理軟件處理。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對所需數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 CSA能夠促進(jìn)ESCs向心肌細(xì)胞分化

加入CSA后GFP陽性的心肌細(xì)胞顯著增加。心肌細(xì)胞分化率：ESCs自發(fā)組為6%，CSA誘導(dǎo)組為60%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖1）。

2.2 CSA作用生成的心肌細(xì)胞正常表達(dá)標(biāo)志物

肌鈣蛋白T（圖2A）和心肌肌小節(jié)α-actinin（圖2B、C）。

2.3 CSA作用在哪一個分化階段

CSA對未分化的ES細(xì)胞向Flk1+細(xì)胞分化過程無任何影響（圖3A）。與ESCs自發(fā)組比較，CSA作用于Flk1+細(xì)胞后，特異地增加FCV細(xì)胞10～20倍（圖3B），F(xiàn)CV最高分化率達(dá)40%，通過FACS計數(shù)，產(chǎn)生的FCV細(xì)胞數(shù)可增加約22倍[ESCs自發(fā)組：（0.2±0.001）×103cells/104 Flk1 cells，CSA誘導(dǎo)組：（4.3±0.23）×103cells/104 Flk1 cells，n=12，P<0.01]（圖3C）。CSA作用于純化的FCV細(xì)胞后，只輕微地增加心肌細(xì)胞的生成，與ESCs自發(fā)組比較，約2.6倍（圖3D），結(jié)果表明CSA誘導(dǎo)心肌的這一新活性，限制在中胚層形成后的分化階段，主要作用于中胚層和心肌干細(xì)胞之間的階段，可有效、特異地誘導(dǎo)擴(kuò)增心肌干細(xì)胞生成。

2.4 CSA這一活性的細(xì)胞和分子機(jī)制

在FLk-第0～6天添加CSA，強(qiáng)力促進(jìn)心肌細(xì)胞生成，相反上皮細(xì)胞或血細(xì)胞生成減少（圖4A）。CSA和FK506都是鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，通過抑制NFAT起到免疫抑制作用。但是，F(xiàn)K506和一種NFAT抑制劑11R-VIVIT，用我們的分化體系對心肌分化無影響（圖4B），說明CSA的促進(jìn)心肌分化活性應(yīng)該是不依賴NFAT途徑的，說明CSA強(qiáng)力促進(jìn)心肌分化的活性應(yīng)該是通過新的機(jī)制被激活，它是特異地作用于中胚層細(xì)胞，通過NFAT非依賴途徑，可特異、有效地擴(kuò)增心肌干細(xì)胞。針對CSA這一活性的確切機(jī)制研究將提供心肌分化和再生的新分子機(jī)制。endprint

3討論

心血管疾病中心肌梗死嚴(yán)重危害人類健康。發(fā)生心肌梗死的心肌組織不能再生，存活心肌組織代償能力滿足不了機(jī)體需要時，逐漸導(dǎo)致心臟泵功能衰竭，各種保守治療不可能從根本上解決問題，心臟移植受方方面面限制，困擾了臨床治療。研究者們必然尋找新的、更有效的治療方法。隨著細(xì)胞和組織工程研究的不斷發(fā)展，干細(xì)胞移植技術(shù)在治療心血管疾病中備受矚目[6-8]。然而，細(xì)胞治療應(yīng)用于心肌梗死的治療，確切的作用機(jī)制尚未完全闡明，臨床應(yīng)用的有效性和安全性仍然是目前研究者們關(guān)注和爭論的焦點(diǎn)[9-10]。

研究者們一直試圖找到一種體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的方法，理想的方法無疑是耗費(fèi)少，效率和純度高、產(chǎn)量大，才符合臨床應(yīng)用的要求。本研究應(yīng)用發(fā)現(xiàn)的CSA作用于中胚層的新功能，提出了一種特異有效地從ESCs擴(kuò)增心肌細(xì)胞的方法。免疫抑制劑CSA是一種鈣調(diào)磷酸酶拮抗劑，能夠阻斷T細(xì)胞內(nèi)的NFAT的信息通路，從而發(fā)揮免疫抑制劑的作用[11]。多項研究還發(fā)現(xiàn)CSA參與了許多其他的細(xì)胞活動，比如心臟瓣膜的形成[12]，心肌肥厚[13]和毛發(fā)的生長[14]。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)CSA作用于擬胚體有微弱地促心肌分化作用[15]，能否促心肌細(xì)胞分化及進(jìn)一步的分子機(jī)制不清楚。這種不同于擬胚體的分階段胚胎干細(xì)胞分化系統(tǒng)應(yīng)該能夠明確地挖掘出CSA的強(qiáng)力作用于中胚層和新的非NFAT依賴的活性，而這一活性被擬胚體中細(xì)胞混合物所掩蓋。這種培養(yǎng)系統(tǒng)將有利于應(yīng)用生化技術(shù)篩選小分子化合物，從而發(fā)現(xiàn)新的促心肌再生藥物。

相對CSA強(qiáng)力促進(jìn)心肌細(xì)胞分化的作用，另一種鈣調(diào)磷酸酶抑制劑——FK506卻沒有顯現(xiàn)出促心肌分化的活性。FK506通過與FKBP12結(jié)合而發(fā)揮各種活性，與CSA在結(jié)構(gòu)，結(jié)合蛋白和藥代學(xué)等方面有些不同。未來圍繞CSA這一活性的機(jī)制研究將有助于揭開心肌分化和再生的分子機(jī)制。

CSA具有悠久的臨床應(yīng)用歷史，它的安全性已經(jīng)得到證實(shí)[16]。相信不久的將來，應(yīng)用CSA擴(kuò)增心肌細(xì)胞的方法將會被應(yīng)用于臨床，被廣泛用于心肌再生的治療。

近幾年，誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（iPS）通過轉(zhuǎn)入特定的轉(zhuǎn)錄因子，成功地從人體細(xì)胞產(chǎn)生[17-20]。這種CSA介導(dǎo)的心肌分化方法將擴(kuò)展應(yīng)用到iPS分化中，將會廣泛益于心肌再生的發(fā)展。

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（收稿日期：2017-02-08 本文編輯：許俊琴）endprint