盧 昊，劉 婷，陳 宇，毛彤春，雷澤源，樊東力 (第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院整形外科，重慶 400037)

皮膚成纖維細胞是皮膚真皮中最主要的細胞成分，在合成分泌纖維和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中扮演著重要的角色。在皮膚受到創(chuàng)傷后，皮膚成纖維細胞作為主要修復(fù)細胞，在趨化因子的作用下由創(chuàng)周向創(chuàng)面移位，并分泌細胞外基質(zhì)成分，如Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ)、層聯(lián)蛋白等，成纖維細胞與ECM相互作用，在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。而當(dāng)皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中成纖維細胞過度增殖，則會導(dǎo)致瘢痕或瘢痕疙瘩的出現(xiàn)，影響形體的美觀，乃至影響功能。故如何調(diào)控皮膚成纖維細胞的增殖成為皮膚創(chuàng)傷修復(fù)和阻止瘢痕形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但目前調(diào)控皮膚成纖維增殖的機制尚不清楚。本研究旨在探討LATS1-YAP信號通路對人皮膚成纖維細胞HS27增殖及細胞外基質(zhì)合成的調(diào)控作用，以期為皮膚創(chuàng)傷后修復(fù)以及阻止創(chuàng)傷后瘢痕形成提供潛在治療靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料和實驗分組

人皮膚成纖維細胞HS27購自ATCC。DMEM培養(yǎng)基、優(yōu)等胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司，LATS1 siRNA、YAP siRNA由上海生物工程有限公司合成。LATS1兔單克隆抗體、YAP兔單克隆抗體、collagenⅠ兔單克隆抗體均購自英國Abcam公司。蛋白提取試劑盒、二抗辣根酶標記山羊抗兔、GAPDH兔多克隆抗體均購自北京天德悅生物科技公司。BeyoECL plus(超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司。lipofectmine2000購自美國Invitrogen公司。

LATS1 siRNA干預(yù)組:使用LATS1 siRNA對HS27細胞進行干預(yù);YAP siRNA干預(yù)組:使用YAP siRNA對HS27細胞進行干預(yù);未干預(yù)組HS27細胞只加入等量的培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將人皮膚成纖維細胞HS27培養(yǎng)于含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，實驗中選用對數(shù)生長期細胞。

1.2.2 LATS1 siRNA和YAP siRNA的轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d將對數(shù)生長期的HS27細胞分別接種6孔細胞培養(yǎng)板，每孔1×105個細胞。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，待培養(yǎng)板中細胞約60%融合時開始轉(zhuǎn)染。取無血清DMEM培養(yǎng)基240 μl與10 μl lipofectmine2000混勻，再取無血清 DMEM 培養(yǎng)基240 μl與10μlLATS1/YAPsiRNA混勻，放置5～10min后將上述2種溶液混合，再放置20 min。將6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)基吸出，用PBS洗滌1次后將脂質(zhì)體siRNA混合液加入培養(yǎng)板，孵育6 h后吸取培養(yǎng)基，換為10%FBS的高糖DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 檢測 LATS1、YAP和collagenⅠ蛋白表達 收集各組細胞，加細胞蛋白提取液提取總蛋白，置于冰中裂解約20 min后，用細胞刮收集細胞于EP管中，4℃1 2 0 0 0 r/min離心10 min，取上清用核酸蛋白檢測儀測蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)成一致，加入5×Loading buffer后在沸水中煮5 min變性。配制8%分離膠、5%濃縮膠后進行SDS-PAGE凝膠電泳，300 mA濕轉(zhuǎn)120 min，將PVDF膜置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入5%脫脂奶粉稀釋的LATS1、YAP和collagenⅠ一抗(稀釋濃度均為1∶1 000)中4℃孵育過夜，次日用TBST漂洗6次，每次5 min，放入5%脫脂奶粉稀釋的辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶5 000)抗體中室溫孵育1 h，TBST漂洗6次，每次5 min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，以GADPH內(nèi)參蛋白校正。

1.2.4 檢測HS27細胞的活力 以每孔103個細胞將HS27細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μl，每組設(shè)5個復(fù)孔，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進行轉(zhuǎn)染，待轉(zhuǎn)染48 h后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μl，繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄培養(yǎng)孔內(nèi)上清液。每孔加入150 μl DMSO，輕微振蕩10 min，使結(jié)晶物完全溶解，酶標儀選擇490 nm波長，測定各孔吸光度(A)值，空白對照孔調(diào)零。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用Image-Pro Plus 10.0對電泳圖像進行分析;使用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，各實驗至少重復(fù)3次，2組均數(shù)間比較用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同干預(yù)條件下LATS1蛋白的表達

LATS1 siRNA干預(yù)組LATS1蛋白表達顯著低于未干預(yù)組(P＜0.05)，YAP siRNA干預(yù)組LATS1蛋白表達與未干預(yù)組無顯著差異(P＞0.05)，LATS1 siRNA干預(yù)組LATS1蛋白的表達顯著低于YAP siRNA干預(yù)組(P＜0.05)，見圖1。

2.2 不同干預(yù)條件下YAP蛋白的表達

LATS1 siRNA干預(yù)組YAP蛋白表達顯著高于未干預(yù)組(P＜0.05)，YAP siRNA干預(yù)組YAP蛋白表達顯著低于未干預(yù)組(P＜0.05)，LATS1 siRNA干預(yù)組YAP蛋白的表達顯著高于YAP siRNA 干預(yù)組(P ＜0.05)，見圖2。

2.3 不同干預(yù)條件下collagenⅠ蛋白的表達

LATS1 siRNA干預(yù)組collagenⅠ蛋白表達顯著高于未干預(yù)組(P＜0.05)，YAP siRNA干預(yù)組collagenⅠ蛋白表達顯著低于未干預(yù)組(P＜0.05)，LATS1 siRNA干預(yù)組collagenⅠ蛋白的表達顯著高于YAP siRNA干預(yù)組(P＜0.05)，見圖3。

圖1 LATS1蛋白的表達

圖2 YAP蛋白的表達

圖3 collagenⅠ蛋白的表達

2.4 不同干預(yù)條件下HS27的活性

LATS1 siRNA干預(yù)組HS27細胞活力顯著高于為未干預(yù)組(P＜0.05)，YAP siRNA干預(yù)組HS27細胞活力顯著低于未干預(yù)組(P＜0.05)，LATS1 siRNA干預(yù)組HS27細胞活力顯著高于YAP siRNA 干預(yù)組(P ＜0.05)，見圖4。

圖4 HS27細胞的活性變化

3 討論

皮膚是人身體最大的器官，主要承擔(dān)著保護身體、排汗、感覺冷熱和壓力的功能，使體內(nèi)各種組織和器官免受物理性、機械性、化學(xué)性和病原微生物侵襲。當(dāng)皮膚受到損傷后，身體中多種細胞內(nèi)外信號通路激活，使成纖維細胞、免疫細胞(如中性粒細胞、單核細胞、樹突細胞)、內(nèi)皮細胞等胞內(nèi)一些相關(guān)基因表達、細胞的極性發(fā)生顯著的改變，導(dǎo)致細胞的增殖、遷移、分化，從而修復(fù)皮膚創(chuàng)傷［1-2］。多數(shù)皮膚受損后修復(fù)時會出現(xiàn)成纖維細胞的過度增殖和ECM的紊亂，從而導(dǎo)致瘢痕的出現(xiàn)［3］，極少數(shù)皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中會出現(xiàn)異常增生和惡變［4］，但目前尚無有效方法阻止瘢痕的形成甚至惡變，其主要原因是調(diào)控真皮層成纖維細胞增殖的機制尚不清楚。

LATS1和YAP蛋白是Hippo信號通路中的關(guān)鍵元件。Hippo信號通路具有調(diào)節(jié)器官體積、保持細胞增殖凋亡平衡、參與細胞接觸性抑制調(diào)控等作用［5-6］，而該通路的異?；蚴Щ羁蓪?dǎo)致細胞的異常增殖以及腫瘤的形成［7］。研究發(fā)現(xiàn)LATS1基因敲除后，小鼠常死于胚胎階段，即使存活下來也伴有腫瘤發(fā)生［8］，提示LATS1在細胞增殖、分化以及抑制腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。YAP是經(jīng)典Hippo通路的主要效應(yīng)因子，被其上游Wts磷酸化而失活，YAP的過度表達會造成組織器官的增大，相反YAP的失活會造成組織器官萎縮。Hippo通路中其他因子的突變(如LATS1)受到抑制能增加YAP的活性，導(dǎo)致下游轉(zhuǎn)錄因子cyclinE、DIAP1等表達增加，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡［9］。本研究同樣證實了抑制LATS1，增加了YAP的表達，從而促進了細胞的活力，相反YAP受到抑制后，HS27細胞活力也顯著下降。

皮膚中存在多種膠原蛋白，其中collagenⅠ是含量最豐富的膠原蛋白，占其干重的90%以上［10］。真皮層collagenⅠ的減少是皮膚皺紋形成的主要原因，同時皮膚創(chuàng)傷修復(fù)時紊亂collagenⅠ是形成瘢痕的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［11］，提示膠原蛋白的合成對維持組織的完整性發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β和其他的細胞因子可促進collagenⅠmRNA的翻譯和轉(zhuǎn)錄［12-13］，而MMPs可負性調(diào)節(jié) collagenⅠ的表達［14］。其他研究指出抑制Smad2/3的表達可顯著下調(diào)collagenⅠ合成［15］。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制LATS1時，collagenⅠ的合成增加，相反抑制 YAP時，collagenⅠ蛋白表達顯著下調(diào)，提示LATS1-YAP信號通路可調(diào)控collagenⅠ的表達，但其機制尚不清楚，需進一步進行研究。

［1］Singer AJ，Clark RA.Cutaneous wound healing［J］.N Engl J Med，1999，341(10)，738 －746.

［2］Aarabi S，Longaker MT，Gurtner GC.Hypertrophic scar formation following burns and trauma:new approaches to treatment［J］.PLoS Med，2007，4(9):e234.

［3］Opalenik SR，Davidson JM.Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair［J］.FASEB J，2005，19(11):1561 －1563.

［4］Trent JT，Kirsner RS.Wounds and malignancy［J］.Adv Skin Wound Care，2003，16(1):31 －34.

［5］Zhao B，Lei QY，Guan KL.The Hippo-YAP pathway:new connections between regulation of organ size and cancer［J］.Curr Opin Cell Biol，2008，20(6):638 －646.

［6］Zhao B，Wei X，Li W，et al.Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control［J］.Genes Dev，2007，21(21):2747 － 2761.

［7］Da CL，Xin Y，Zhao J，et al.Significance and relationship between Yesassociated protein and surviving expression in gastric carcinoma and precancerous lesions［J］.World J Gastroenterol，2009，15(32):4055 －4061.

［8］St John MA，Tao W，F(xiàn)ei X，et al.Mice deficient of Lats1 develop soft-tissue sarcomas，ovarian tumours and pituitary dysfunction［J］.Nat Genet，1999，21(2):182 －186.

［9］Zhang J，Ji JY，Yu M，et al.YAP-dependent induction of amphiregulin identifies a non cell autonomous component of the Hippo pathway［J］.Nat Cell Biol，2009，11(12):1444 －1450.

［10］Takasao N，Tsuji-Naito K，Ishikura S，et al.Cinnamon extract promotes type I collagen biosynthesis via activation of IGF-I signaling in human dermal fibroblasts［J］.J Agric Food Chem，2012，60(5):1193 － 1200.

［11］Gurtner GC，Werner S，Barrandon Y，et al.Wound repair and regeneration［J］.Nature，2008，453(7193):314 － 321.

［12］Honda N，Jinnin M，Kajihara I，et al.TGF-β-mediated downregulation of microRNA-196a contributes to the constitutive upregulated type I collagen expression in scleroderma dermal fibroblasts［J］.J Immunol，2012，188(7):3323 －3331.

［13］Amento EP，Ehsani N，Palmer H，et al.Cytokines and growth factors positively and negatively regulate interstitial collagen gene expression in human vascular smooth muscle cells［J］.Arterioscler Thromb，1991，11(5):1223－1230.

［14］Enjoji M，Kotoh K，Iwamoto H，et al.Self-regulation of type I collagen degradation by collagen-induced production of matrix metalloproteinase-1 on cholangiocarcinoma and hepatocellular carcinoma cells［J］.In Vitro Cell Dev Biol Anim，2000，36(2):71 －73.

［15］Cho JW，II KJ，Lee KS.Downregulation of type I collagen expression in silibinin-treated human skin fibroblasts by blocking the activation of Smad2/3-dependent signaling pathways:potential therapeutic use in the chemoprevention of keloids［J］.Int J Mol Med，2013，31(5):1148－1152.