張 麗，余保平，楊 斌，潘陳為，肖 勇

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430060

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是繼NO和CO之后的第3種氣體信號(hào)分子，參與機(jī)體多種病理生理學(xué)反應(yīng)。內(nèi)源性H2S主要是半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthetase，CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)和半胱氨酸轉(zhuǎn)移酶催化作用下產(chǎn)生的[1]。其中CBS是腦中產(chǎn)生H2S的主要酶，CSE則主要分布在神經(jīng)系統(tǒng)外的組織。在消化系統(tǒng)內(nèi)，胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、肝臟以及胰腺組織均存在CSE，并可產(chǎn)生內(nèi)源性H2S[2]。而膽囊組織中是否存在CSE尚未見報(bào)到。本研究采用膽總管結(jié)扎方法構(gòu)建急性非結(jié)石性膽囊炎(acute acalculous cholecystisis，AAC)模型，觀察膽囊組織中H2S/CSE體系的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年豚鼠30只(武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物中心提供)，雄性，體質(zhì)量250～350 g。飼養(yǎng)環(huán)境為:溫度20～25℃，濕度40% ～60%。GAPDH單克隆抗體、CSE多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，羊抗兔二抗購(gòu)自北京中衫生物試劑公司，Western blotting相關(guān)試劑購(gòu)自碧云天公司進(jìn)口分裝。

1.2 方法 本實(shí)驗(yàn)共分為3組:正常組、假手術(shù)對(duì)照組(Sham組)、膽總管結(jié)扎48 h(BDL-48 h)組。每組8只。

1.2.1 模型構(gòu)建[3]:戊巴比妥鈉(50 mg/kg 體質(zhì)量)腹腔麻醉后，腹部備皮，消毒。劍突下1 cm左右沿腹中線切口，游離膽總管，在膽管進(jìn)入十二指腸入口處結(jié)扎膽總管(3-0線)。膽囊不作任何操作。依次縫合肌層、皮膚。切口氫氧化物消毒，常規(guī)消毒包扎處理。假手術(shù)組不結(jié)扎膽總管，其他處理與上述一致。待動(dòng)物清醒后，將其轉(zhuǎn)移到籠內(nèi)(可以自由喂食及飲水)。實(shí)驗(yàn)時(shí)間后收集各組膽囊標(biāo)本。

1.2.2 HE染色鑒定模型:取各組膽囊標(biāo)本，4%多聚甲醛液室溫固定4～6 h后，石蠟包埋、切片，4～5 μm厚。行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察膽囊病理學(xué)改變。膽囊炎癥的評(píng)定由2位病理學(xué)醫(yī)師獨(dú)立雙盲評(píng)分[4]。

1.2.3 膽囊組織CSE活性測(cè)定:參照文獻(xiàn)[5]，將磷酸鉀緩沖液(100 mmol/L，pH 7.4)加入膽囊組織，冰上研磨，制備成勻漿。取含有中央小室的錐形瓶。外室反應(yīng)體系由磷酸鉀緩沖液(pH 7.4)、L-半胱氨酸(10 mmol/L)、5'-磷酸吡多醛(2 mmol/L)和10%(w/v)組織勻漿組成。中央小室內(nèi)加入1%醋酸鋅，并置入2.0 cm×2.5 cm濾紙。錐形瓶充入氮?dú)?0 s后嚴(yán)密封閉瓶口。37℃搖床孵育90 min后，加50%三氯醋酸終止反應(yīng)。將中央小室內(nèi)容物移入到含3.6 ml蒸餾水的試管中，加入對(duì)氨基二甲基苯二胺鹽酸鹽(20 mol/L)和三氯化鐵(30 mol/L)，室溫孵育20 min。分光光度計(jì)在670 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。根據(jù)NaHS標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算組織H2S含量。CSE活性以每毫克組織每分鐘生成H2S的量表示，單位為 μmol· min－1·g－1。

1.2.4 膽囊組織CSE蛋白的表達(dá)定位:采用SP試劑盒進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。將保存于4%多聚甲醛中的膽囊組織取出，石蠟包埋、切片。常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)。加一抗4℃孵育過(guò)夜、隔日加二抗孵育20 min、37℃孵育20 min，DAB顯色。蘇木素復(fù)染，蒸餾水沖洗返藍(lán)，梯度酒精逐級(jí)脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。結(jié)果判斷:顯微鏡下胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色片狀或顆粒狀物為陽(yáng)性。

1.2.5 膽囊組織CSE蛋白含量的測(cè)定:采用Western免疫印跡法檢測(cè)，用組織裂解液提取總蛋白后，4℃12000 r/min離心30 min。BCA法測(cè)定蛋白濃度。制備12%的PAGE膠，按50 μg蛋白/泳道加樣，電泳后按恒流200 mA轉(zhuǎn)膜。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，加一抗(稀釋度1∶200)，4℃搖床過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記的抗兔二抗(1∶2000)，室溫孵育1 h。洗膜后加入ECL(enhanced chemilumine scence)發(fā)光液，暗室中曝光。凝膠成像分析系統(tǒng)上攝像分析，測(cè)得目標(biāo)帶的灰度值，進(jìn)而計(jì)算出各組樣品CSE目標(biāo)帶與內(nèi)參GAPDH的灰度值之比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果用表示，各組比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色及組織病理炎癥評(píng)分 正常組與Sham組膽囊組織各層結(jié)構(gòu)完整，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。BDL-48 h組可見血管增生、擴(kuò)張、充血及出血，伴組織水腫以及成纖維細(xì)胞增生。大量炎性細(xì)胞浸入(主要為中性粒細(xì)胞)黏膜層、肌層及漿膜層(見圖1)。正常組與Sham組炎癥評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。BDL-48 h炎癥評(píng)分較正常組和Sham組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表1)。

圖1 各組豚鼠膽囊組織HE染色(200×)A:正常組;B:Sham組;C:BDL-48 h組Fig1 Photomicrographs of gallbladder samples stained with hematoxylin and eosin in each group(200×)A:normal group;B:sham group;C:BDL-48 h group

2.2 膽囊組織中CSE活性的變化 BDL-48 h組較正常組和Sham組膽囊組織中CSE活性顯著增高(P＜0.05，見表 1)。

2.3 免疫組化檢測(cè)CSE蛋白的表達(dá)定位 CSE蛋白主要定位于胞質(zhì)和胞膜。在正常組與Sham組膽囊組織中，CSE免疫陽(yáng)性主要表達(dá)于黏膜上皮組織層、漿膜層;而在BDL-48 h組，CSE蛋白在黏膜層、漿膜層以及血管內(nèi)皮層均有表達(dá)(見圖2)。

2.4 免疫印跡法測(cè)定CSE蛋白表達(dá)變化 正常組與Sham組膽囊組織CSE蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而BDL 48 h后，CSE 蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表1、圖3)。

圖2 各組豚鼠膽囊組織CSE陽(yáng)性細(xì)胞(400×)A:正常組;B:Sham組;C:BDL-48 h組Fig2 Representative sections for CSE staining in gallbladder tissues in each group(400×)A:normal group;B:sham group;C:BDL-48 h group

圖3 Western blotting檢測(cè)各組鼠膽囊組織CSE蛋白表達(dá)A:正常組;B:Sham組;C:BDL-48 h組Fig3 CSE proteins expression of guinea pig gallbladder in each group A:normal group;B:sham group;C:BDL-48 h group

表1 各組豚鼠膽囊組織炎癥評(píng)分、CSE活性和CSE蛋白表達(dá)()Tab1 Inflammation score，CSE activity and CSE protein expression in gallbladder tissue of guinea pigs from different groups()

表1 各組豚鼠膽囊組織炎癥評(píng)分、CSE活性和CSE蛋白表達(dá)()Tab1 Inflammation score，CSE activity and CSE protein expression in gallbladder tissue of guinea pigs from different groups()

注:與正常組和Sham組比較，*P＜0.05。

組別 炎癥評(píng)分CSE活性(μmol·min－1·g－1)CSE蛋白1.32 ±0.21 27.60 ±6.98 53 ±9.12 Sham 組 1.67 ±0.25 33.80 ±3.61 59 ±7.23 BDL-48 h 組 5.33 ±0.42* 57.21 ±9.99* 89 ±8.93正常組*

3 討論

本研究通過(guò)組織化學(xué)以及免疫印跡方法，證實(shí)豚鼠膽囊組織中存在合成內(nèi)源性H2S的關(guān)鍵酶CSE。文獻(xiàn)[6]報(bào)道，CBS和CSE在小鼠結(jié)腸黏膜組織均有表達(dá)，但僅CSE可表達(dá)于外肌層與肌間神經(jīng)叢。Schicho等[7]研究顯示，CBS和CSE廣泛表達(dá)于人類黏膜下層和腸肌層的神經(jīng)元，但不表達(dá)于人結(jié)腸上皮細(xì)胞。我們的研究表明，CSE可以在膽囊黏膜上皮層、漿膜層以及血管內(nèi)皮層表達(dá)。這些結(jié)果表明CSE在體內(nèi)的表達(dá)存在種屬差異和分布差異。

急性非結(jié)石性膽囊炎(AAC)是指影像學(xué)、術(shù)中及病理學(xué)檢查膽囊內(nèi)無(wú)結(jié)石，卻存在明顯炎癥的膽囊疾病[8]。AAC的病理基礎(chǔ)包括膽囊血管系統(tǒng)變化、組織缺血壞死、細(xì)菌感染以及膽汁淤積。BDL是構(gòu)建AAC有效且常用的動(dòng)物模型[3]。本實(shí)驗(yàn) HE染色顯示，BDL 48 h后，膽囊組織急性炎癥狀態(tài)明顯增加，與Soylu 等[3]的研究結(jié)果一致。

H2S具有抗炎和促炎雙重效應(yīng)。預(yù)防性給予NaHS可以降低非甾體類抗炎藥(NSAID)所致的胃黏膜血流減少以及白細(xì)胞在血管的黏附。然而在角叉菜膠致大鼠足跖腫脹、急性胰腺炎、內(nèi)毒素血癥以及嚴(yán)重感染性休克的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭衃2]，H2S則表現(xiàn)出明顯的促炎作用。Zanardo等[9]指出 H2S產(chǎn)生于機(jī)體炎癥部位，可以抑制白細(xì)胞黏附血管內(nèi)皮組織并減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫形成。H2S通過(guò)激活NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性促進(jìn)急性胰腺炎的發(fā)生[10];在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展中，H2S可以抑制NF-κB活性，從而減少炎癥產(chǎn)生[11]。由此推測(cè)，H2S的抗炎或促炎作用與動(dòng)物模型以及產(chǎn)生部位有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常膽囊組織，CSE主要表達(dá)于黏膜上皮層和漿膜層;而在AAC模型組，膽囊組織血管增生、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，CSE蛋白在黏膜層、漿膜層以及血管內(nèi)皮層均有表達(dá)，且模型組的CSE活性以及CSE蛋白表達(dá)量顯著高于正常組，表明H2S/CSE體系與膽囊炎癥有關(guān)。另外，CSE在血管內(nèi)皮的表達(dá)增高可能提示，H2S在白細(xì)胞的黏附、浸潤(rùn)過(guò)程中起抑制或促進(jìn)作用。

近年來(lái)研究證實(shí)，H2S在調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力[12]、保護(hù)腸缺血再灌注損傷[13]等方面有非常重要的作用。外源性H2S通過(guò)激活A(yù)TP敏感鉀通道降低豚鼠胃的自發(fā)性收縮;而內(nèi)源性H2S則抑制電壓依賴性鉀通道促進(jìn)胃平滑肌運(yùn)動(dòng)[12]。硫氫化鈉預(yù)處理后，大鼠小腸的缺血再灌注損傷減少，可能的機(jī)制是H2S激活鈣激活鉀通道使腸道黏膜細(xì)胞的線粒體損傷降低[13]。趙夢(mèng)等[14]研究顯示，膽管梗阻后，膽囊平滑肌肌條對(duì)各種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的效應(yīng)性降低，而產(chǎn)生的原因與膽囊的炎癥程度密切相關(guān)[15]。我們推測(cè)，炎癥部位產(chǎn)生的H2S可能影響膽囊平滑肌的收縮功能，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上可見，膽囊組織存在合成H2S的關(guān)鍵酶CSE。H2S/CSE體系可能參與了AAC的炎癥、動(dòng)力改變等病理過(guò)程。

[1]Stipanuk MH，Beck PW.Characterization of the enzymic capacity for cysteine desulphhydration in liver and kidney of the rat[J].Biochem J，1982，206(2):267-277.

[2]Wang R.Physiological implications of hydrogen sulfide:a whiff exploration that blossomed[J].Physiol Rev，2012，92(2):791-896.

[3]Soylu S，Aydin C，Bagcivan I，et al.Effects of NO/L-arginine pathway on gallbladder contractility in bile duct ligated guinea pigs[J].J Surg Res，2009，155(1):70-76.

[4]McCarthy J，O＇Mahony L，O＇Callaghan L，et al.Double blind，placebo controlled trial of two probiotic strains in interleukin 10 knockout mice and mechanistic link with cytokine balance[J].Gut，2003，52(7):975-980.

[5]Zhang H，Moochhala SM，Bhatia M.Endogenous hydrogen sulfide regulates inflammatory response by activating the ERK pathway in polymicrobial sepsis[J].J Immunol，2008，181(6):4320-4331.

[6]Linden DR，Sha L，Mazzone A，et al.Production of the gaseous signal molecule hydrogen sulfide in mouse tissues[J].J Neurochem，2008，106(4):1577-1585.

[7]Schicho R，Krueger D，Zeller F，et al.Hydrogen sulfide is a novel prosecretory neuromodulator in the Guinea-pig and human colon [J].Gastroenterology，2006，131(5):1542-1552.

[8]Zhou L，Ke MY.Gastrointestinal motility[M].Beijing:Science Press，1999:293-303周呂，柯美云.胃腸動(dòng)力學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社，1999:293-303.

[9]Zanardo RC，Brancaleone V，Distrutti E，et al.Hydrogen sulfide is an endogenous modulatorofleukocyte-mediated inflammation [J].FASEB J，2006，20(12):2118-2120.

[10]Tamizhselvi R，Shrivastava P，Koh YH，et al.Preprotachykinin-A gene deletion regulates hydrogen sulfide-induced toll-like receptor 4 signaling pathway in cerulein-treated pancreatic acinar cells[J].Pancreas，2011，40(3):444-452.

[11]Wang Y，Zhao X，Jin H，et al.Role of hydrogen sulfide in the development of atherosclerotic lesions in apolipoprotein E knockout mice[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29(2):173-179.

[12]Zhao P，Huang X，Wang ZY，et al.Dual effect of exogenous hydrogen sulfide on the spontaneous contraction of gastric smooth muscle in guinea-pig[J].Eur J Pharmacol，2009，616(1-3):223-228.

[13]Liu Y，Kalogeris T，Wang M，et al.Hydrogen sulfide preconditioning or neutrophil depletion attenuates ischemia-reperfusion-induced mitochondrial dysfunction in rat small intestine[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2012，302(1):G44-G54.

[14]Zhao M，Yu BP，Xiao Y，et al.Effects of acute acalculous cholecystitis induced by bile duct ligation on the contraction of extracorporea l gallbladder smooth muscle of guinea pigs[J].Chin J Gastroenterol Hepatol，2010，19(3):230-233.趙夢(mèng)，余保平，肖勇，等.膽道梗阻誘發(fā)急性膽囊炎對(duì)豚鼠膽囊平滑肌收縮的影響[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2010，19(3):230-233.

[15]Parkman HP，Bogar LJ，Bartula LL，et al.Effect of experimental acalculous cholecystitis on gallbladder smooth muscle contractility[J].Dig Dis Sci，1999，44(11):2235-2243.