李柯 夏敏 曹婉瑜 杜瑞卿

摘要 [目的] 優(yōu)化木薯同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的工藝。[方法]在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，通過(guò)前期單因素試驗(yàn)的結(jié)果選取了3個(gè)對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響較大的因素：發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、料水比按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化。[結(jié)果]試驗(yàn)表明，3個(gè)因素對(duì)木薯同步糖化生產(chǎn)燃料乙醇的影響作用的主次順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、料水比;優(yōu)化方案為：料水比 1∶2.5 g/ml，發(fā)酵溫度 32 ℃ ，發(fā)酵時(shí)間 54 h ，優(yōu)化后的發(fā)酵結(jié)果酒度達(dá)到了14.3%（V/V），原料轉(zhuǎn)化率達(dá)到了30.7%。[結(jié)論] 研究可為木薯發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 正交設(shè)計(jì);同步糖化發(fā)酵;乙醇;優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào) S609.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）33-11869-02

Optimization of Technique for Producing Fuel Ethanol by Cassava Simultaneous Saccharification and Fermentation

LI Ke， XIA Min*， CAO Wan-yu et al

（School of Life Science and Technology， Nanyang Normal University， Nanyang， Henan 473061）

Abstract [Objective] To optimize technique for producing fuel ethanol by cassava simultaneous saccharification and fermentation. [Method] Three main influencing factors selected from single factor experiment， including fermentation time， temperature and solid-liquid ratio， were used to conduct the orthogonal test， so as to optimize the fermentation conditions. [Result] The experiment showed that， the order of three factors influencing ethanol production is fermentation time>temperature>solid-liquid ratio. The optimal scheme is： solid-liquid ratio 1∶2.5 g/ml， fermentation temperature 32 ℃， fermentation time 54 h， the concentration of ethanol is up to 14.3%（V/V）， material conversion rate reaches 30.7%. [Conclusion] The study can provide theoretical basis for producing fuel ethanol by cassava fermentation.

Key words Orthogonal design; Simultaneous saccharification and fermentation; Ethanol; Optimization

基金項(xiàng)目 河南省高校工程技術(shù)研究中心“農(nóng)業(yè)生物質(zhì)資源化”資助項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介 李柯（1989- ），女，河南南陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向：生物質(zhì)能源。

*通訊作者，教授，碩士生導(dǎo)師，從事生物質(zhì)能源方面的研究。

收稿日期 2014-10-27

近年來(lái)我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展迅速，對(duì)能源的需求量越來(lái)越大，加上傳統(tǒng)能源的不可再生性，能源問(wèn)題日益凸顯，因此促進(jìn)了可再生能源的快速發(fā)展，燃料乙醇作為新能源代表之一受到廣泛關(guān)注和快速發(fā)展。而最開(kāi)始利用糧食生產(chǎn)燃料乙醇在后期受到了巨大的輿論沖擊，認(rèn)為其影響了糧食安全。在這種情況下，大力發(fā)展非糧燃料乙醇變得很有必要[1-2]。目前的非糧燃料乙醇的原料主要有甘蔗、甜菜、木薯、木質(zhì)纖維素等。就目前的技術(shù)以及當(dāng)?shù)刭Y源而言，木薯是最為合適的非糧燃料乙醇原料。木薯耐旱、耐貧瘠、病害少、易栽培，可以種植在糧食不能生長(zhǎng)的土地上，適宜栽培于熱帶亞熱帶地區(qū)，且方便運(yùn)輸，木薯干淀粉含量可達(dá)68%以上。據(jù)初步估算，僅種植木薯一項(xiàng)，就可以滿(mǎn)足全國(guó)推廣10%燃料乙醇汽油的需要[3]。

最早引入對(duì)同步糖化發(fā)酵（Simultaneous Saccharification and Fermentation，SSF）模式的研究是在對(duì)纖維乙醇的研究中。但是一是纖維乙醇離大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)還有距離，二是這種發(fā)酵模式在纖維乙醇中的應(yīng)用存在不少?zèng)]有解決的難題，人們把這種發(fā)酵模式引入到以淀粉為原料的燃料乙醇生產(chǎn)中。在傳統(tǒng)的以淀粉為原料的燃料乙醇生產(chǎn)中普遍應(yīng)用的是先糖化后發(fā)酵（Separate Hydrolysis and Fermentation，SHF）模式，關(guān)于SSF的研究和應(yīng)用都比較少。事實(shí)上，SSF模式發(fā)酵是一種比SHF效率要高的發(fā)酵模式。

傳統(tǒng)的SHF模式在發(fā)酵階段初期，高濃度的葡萄糖會(huì)對(duì)酵母菌產(chǎn)生葡萄糖抑制作用，從而造成發(fā)酵周期增長(zhǎng)。Montesinos 等以液化后的小麥面粉為原料，比較了SHF模式和先糖化6 h 再用SSF模式及直接應(yīng)用SSF 模式進(jìn)行發(fā)酵的3種過(guò)程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)直接進(jìn)行SSF 過(guò)程的發(fā)酵周期是最短的[4]。蔡柳等用均勻設(shè)計(jì)法研究木薯生料同步發(fā)酵優(yōu)化之后的原料轉(zhuǎn)化率為32.83%，但是發(fā)酵周期選為120 h，這在工業(yè)生產(chǎn)中并不實(shí)用[2]。

筆者進(jìn)行該試驗(yàn)先對(duì)木薯粉漿進(jìn)行高溫液化，糖化發(fā)酵階段則同步進(jìn)行。同步糖化發(fā)酵工藝中糖化和發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行，糖化產(chǎn)出的單糖及時(shí)被酵母菌利用，既能解決分步糖化發(fā)酵中發(fā)酵初期由于葡萄糖濃度過(guò)高造成的葡萄糖抑制發(fā)酵作用，又會(huì)因?yàn)楣拗忻附猱a(chǎn)生的糖分被及時(shí)利用導(dǎo)致沒(méi)有多余的糖分從而避免了雜菌的污染[5-6]。

通過(guò)單因素試驗(yàn)后確定對(duì)發(fā)酵影響較大的因素并選取了其中3個(gè)因素做正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，提高原料出酒率，節(jié)約生產(chǎn)成本，為實(shí)際生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯干，老撾進(jìn)口，粉碎后檢測(cè)淀粉含量為69.3%。

耐高溫α-淀粉酶、糖化酶，諾維信生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

酵母為安琪超級(jí)釀酒高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)前期的單因素試驗(yàn)結(jié)果以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)[2，5]選取了影響發(fā)酵過(guò)程的3個(gè)因素：發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間以及醪液濃度（料水比）作為影響因素進(jìn)行L9（34）正交設(shè)計(jì)，對(duì)3個(gè)因素設(shè)置3個(gè)濃度梯度，濃度梯度及編碼水平見(jiàn)表1。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酵母活化。

干酵母、水、葡萄糖按100∶1 000∶1的比例混勻，30 ℃水浴30 min即可作為酒母使用。

1.3.2 同步糖化發(fā)酵工藝。

將木薯干粉碎過(guò)篩備用，稱(chēng)取60 g木薯粉加150 ml水于500 ml錐形瓶中加入耐高溫α-淀粉酶15 U/g混勻，在95 ℃水浴鍋中蒸煮30 min。降溫至30 ℃加入糖化酶180 U/g和活化后的酵母，酵母按7%的添加量添加，充分混勻。調(diào)整初始pH為4.5后用紗布或?yàn)V膜封口然后置于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)60 h后取出測(cè)定乙醇含量。

表1 優(yōu)化發(fā)酵條件正交試驗(yàn)L9（34）

1.3.3 乙醇產(chǎn)量的測(cè)定。

取100 ml發(fā)酵液和110 ml蒸餾水混合于500 ml的蒸餾瓶中，收集蒸餾液100 ml用酒度計(jì)和溫度計(jì)測(cè)出乙醇濃度及溫度，查校正表得發(fā)酵液乙醇產(chǎn)量。

1.3.4 原料轉(zhuǎn)化率的計(jì)算[2]。公式如下：

原料轉(zhuǎn)化率=0.789 3XV0.938 4M×100%

式中，X，乙醇體積分?jǐn)?shù);V，發(fā)酵液體積（ml）;M，原料總量（g）。

2 結(jié)果與分析

對(duì)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行直觀(guān)分析的結(jié)果如表2所示試驗(yàn)中每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

表2 乙醇產(chǎn)率正交試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)的直觀(guān)分析

對(duì)表2進(jìn)行直觀(guān)分析可以看出，料水比最大的K值是K2，發(fā)酵溫度最大的K值是K2，發(fā)酵時(shí)間最大的K值是K3，即表示3個(gè)影響因素分別在2水平、2水平、3水平上對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響最大。依據(jù)極差R大小，3個(gè)因素作用的大小順序依次是發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、料水比。優(yōu)選方案是A2B2D3，即料水比1∶2.5 g/ml，發(fā)酵溫度32 ℃，發(fā)酵時(shí)間54 h。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。顯著性水平α=0.005，查F分布表，F(xiàn)0.005（2，2）=199。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)算得的料水比的F值703.714，發(fā)酵溫度的F值737.638 1，發(fā)酵時(shí)間的F值4 946.537，都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于查表得到的觀(guān)測(cè)值F（199），這證明這3個(gè)發(fā)酵影響因素在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響作用穩(wěn)定而且差異比較大。從F值的大小得出3個(gè)影響因素對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響的大小順序依次是D因素（發(fā)酵時(shí)間）、B（發(fā)酵溫度）、A（料水比），這與直觀(guān)分析的結(jié)果一致。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證性試驗(yàn)，利用直觀(guān)分析得到的最優(yōu)條件組合做發(fā)酵試驗(yàn)，做3組平行，試驗(yàn)后取3組數(shù)據(jù)的平均值，得到的原料轉(zhuǎn)化率為30.7%，高于試驗(yàn)中的各個(gè)組合得到的原料轉(zhuǎn)化率，說(shuō)明該優(yōu)化組合可行。

3 結(jié)論與討論

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間以及發(fā)酵料水比對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響都是很顯著的。通過(guò)正交試驗(yàn)選擇出的最優(yōu)組合方案是料水比1∶2.5 g/ml，發(fā)酵溫度32 ℃，發(fā)酵時(shí)間54 h，優(yōu)化后的發(fā)酵結(jié)果出酒率達(dá)到了14.3%（V/V），原料轉(zhuǎn)化率達(dá)到了30.7%，在保證轉(zhuǎn)化率的前提下大幅度縮短了發(fā)酵周期。

木薯同步糖化發(fā)酵與傳統(tǒng)的糖化發(fā)酵分步進(jìn)行的發(fā)酵工藝相比，能顯著減少發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率，節(jié)省設(shè)備投資及占地面積;而且同步進(jìn)行糖化發(fā)酵使得淀粉糖化時(shí)產(chǎn)生的葡萄糖能立即被酵母所利用，罐中很少可利用糖分的存在能有效防止雜菌的污染，保證發(fā)酵過(guò)程的順利進(jìn)行;同時(shí)，同步糖化發(fā)酵把糖化和發(fā)酵合為一步進(jìn)行，也簡(jiǎn)化了工序操作，節(jié)約人力和能耗[3，5-6]。

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