謝茹勝，葉燕珠，潘愛萍，吳水華

白芷飲片中總香豆素與歐前胡素、異歐前胡素的含量測定

*謝茹勝1，葉燕珠2，潘愛萍1，吳水華1

(1.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學院，福建，福州 350002；2.福建教育學院，福建，福州 350002)

通過測定白芷傳統(tǒng)飲片中總香豆素、歐前胡素、異歐前胡素的含量，了解其在治療白癜風中的作用和用量。采用紫外-可見分光光度法測定白芷總香豆素的含量，采用高效液相色譜法同時測定歐前胡素、異歐前胡素含量，XB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相組成為甲醇和水(70:30)，流速1 mL·min-1，檢測波長300 nm，流速1.0 mL·min-1。歐前胡素、異歐前胡素在范圍內(nèi)線性良好。本法簡便、快速、準確，可用于白芷中歐前胡素與異歐前胡素的含量測定，為白芷在治療白癜風中的作用和用量提供參考依據(jù)。

白芷；歐前胡素；異歐前胡素；含量測定

白芷為傘形科植物白芷或杭白芷的干燥根。白芷及其提取物在中醫(yī)藥、日化、煙草等行業(yè)廣泛應(yīng)用。現(xiàn)代藥理研究證實白芷具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、平喘、降低動脈壓力、具有較強的生理活性，能抑制銀屑病和治療白癜風，具有拮抗副交感神經(jīng)的作用等[1-2]。白癜風是一種后天性色素脫失皮膚病，黑素細胞破壞是其基本病理改變[3]。黑色素的減少是因為酪氨酸酶活性減弱, 如果使用上調(diào)酪氨酸酶活性藥物，可以提高治療白癜風的療效[4]。實驗研究表明，白芷中含歐前胡素、異歐前胡素，花椒毒素酯等呋喃香豆素類物質(zhì)[5]，這些物質(zhì)具有較強的光敏作用，能激活酪氨酸酶的活性，刺激黑素細胞增強合成黑素的能力，從而可以治療白癜風。

為了研究白芷中香豆素、歐前胡素、異歐前胡素的含量，本研究采用了索氏提取[6]提取了白芷中的香豆素。目前很多研究者采用甲醇作為提取溶劑[6-7]。而通過現(xiàn)代藥理研究白芷提取的香豆素廣泛用于中醫(yī)藥[8-9]，考慮到甲醇的毒性，筆者改用了乙醇作為提取溶劑。用乙醇作為溶劑提取白芷中總香豆素和歐前胡素、異歐前胡素的含量測定鮮見報道，在歐前胡素、異歐前胡素的含量測定中，進行了系統(tǒng)適用性試驗，調(diào)整了流動相比例，不僅能同時測定歐前胡素、異歐前胡素的含量，而且測定分析時間大大縮短，提高了測定分析的工作效率，為今后測試白芷中歐前胡素和異歐前胡素提供了參考。

1 儀器與試藥

1.1 藥物與試劑

傳統(tǒng)白芷飲片（產(chǎn)地：安徽）、歐前胡素(批號：130311，純度≥ 98%)和異歐前胡素對照品(批號：130328，純度≥ 98%)均購于天津一方科技有限公司，試劑乙醇為分析純，甲醇為色譜純。

1.2 儀器

紫外-可見分光光度計（UV-1800PC-DS2），高效液相色譜系統(tǒng)（島津LC-10A）；VWD檢測器；AB265-S電子天平(METTLER TOLEDO)；超聲波清洗器（型號KQ-500B ，鞏義市予華儀器廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總香豆素的測定

本研究用紫外-可見分光光度法測定了用乙醇作為提取溶劑的白芷中總香豆素的含量[10]。白芷主要含有歐前胡素、異歐前胡素、花椒毒酚、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素等香豆素。根據(jù)吸光度隨歐前胡素濃度變化的標準曲線，可以看出歐前胡素對照品溶液濃度在范圍內(nèi)，吸光度與濃度的線性關(guān)系良好，因此可以測定樣品在300 nm處的紫外吸收值即可通過該標準曲線計算得到以歐前胡素表示的總香豆素含量。

2.1.1 檢測波長的選擇

由于香豆素成分結(jié)構(gòu)的差異，導致樣品的紫外吸收峰型很不規(guī)則。通過考察歐前胡素、異歐前胡素在300 nm附近有紫外吸收峰，如圖1。白芷提取液在300 nm處均有較強的吸收，而且峰型變化平緩，便于定量測定。故本研究采用300 nm作為測定波長。

圖1 歐前胡素對照品及總香豆素提取液紫外光譜圖

2.1.2對照品的制備

精密稱取歐前胡素對照品1.82 mg，置50 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

2.1.3 供試品溶液的制備

精密稱取白芷樣品粉末約5 g，精密稱定，置索氏提取器中，加95 %乙醇200 mL，加熱回流4 h，提取液濃縮至適量，取出置50 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 線性范圍考察

分別移取上述對照品溶液1，2，3，4，5 mL于10 mL量瓶，加乙醇至刻度，分別搖勻即得系列對照品溶液，在300 nm處分別測定吸光度。以吸光度為縱坐標，溶度為橫坐標，繪制標準曲線如圖1，得線性回歸方程為= 0.0572x（R2= 0.9995），線性范圍為1.98 ~9.90 μg/mL。

取供試品溶液稀釋適量，測其吸光度，根據(jù)稀釋的倍數(shù)和上述線性方程y = 0.0572x 計算得到傳統(tǒng)白芷飲片中總香豆素的含量為0.635%。

圖2 吸光度隨歐前胡素濃度的變化

Fig.2 Standard curve of concentration-absorption of imperatorin

2.2 歐前胡素、異歐前胡素的含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：XB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇一水(70:30)，等濃度洗脫，流速：1 mL/min-1。檢測波長：300 nm。在此條件下，歐前胡素、異歐前胡素與白芷飲片中其他成分能達到基線分離（R﹥1.5），理論塔板數(shù)按歐前胡素峰計算不低于3000。對照品及供試品色譜圖見圖3和圖4。

（1.歐前胡素 2.異歐前胡素）

（1.歐前胡素 2.異歐前胡素）

2.2.2 歐前胡素、異歐前胡素對照品的配制

分別稱取歐前胡素、異歐前胡素對照品1 mg，精密稱定，配制成50 mL量瓶中，以乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得貯備液。

2.2.3 線性范圍的考察

分別配制歐前胡素、異歐前胡素系列標準溶液。分別精密吸取20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以對照品溶度對橫坐標，峰面積（A）積分值為縱坐標，繪制標準曲線，并計算回歸方程。結(jié)果見圖5和圖6。歐前胡素線性范圍為1.98~9.90 μg/mL，線性范圍為1.13 ~11.3 μg/mL。結(jié)果表明，歐前胡素、異歐前胡素在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖5 歐前胡素峰面積隨濃度的變化曲線

圖6 異歐前胡素對照品及總香豆素提取液紫外光譜圖

2.2.4 精密度試驗

按上述色譜條件，以歐前胡素、異歐前胡素對照品連續(xù)進樣5次，以峰面積計算，歐前胡素的RSD = 0.9%，異歐前胡素的RSD = 0.7%。

2.2.5 樣品含量測定

取2.1.3項下超聲提取供試液經(jīng)濾膜過濾，精密吸取20 μL，注入高效液相色譜儀，重復進樣3次，測定峰面積，根據(jù)2.2.2項下標準曲線分別計算出白芷樣品中歐前胡素、異歐前胡素平均含量分別為0.092%、0.094%。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗

取2.2.5項下供試品溶液，在室溫下放置，按上述色譜條件，分別在1、3、5、7、9 h 測定，以峰面積計算，歐前胡素的RSD = 0.5%，異歐前胡素的RSD = 0.6%，表明供試品溶液在9 h 內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)論

筆者通過調(diào)查了解到漳州龍海地區(qū)民間治療白癜風的中藥材主要有復方中藥白芷等其他成分，取5 g研磨打成粗粒，加入煤油中浸泡，每天用棉簽涂藥液于患處，每日數(shù)次，連續(xù)涂4 d左右，白斑皮膚開始變紅后漸黑，一周后灶部位皮膚（即黑色部分）可以剝離一薄層皮膚，兩周后灶部位皮膚可恢復正常膚色。盡管療效顯著，但是其作用機理不明確，存在溶出差、粘著性差及使用不方便等問題。

根據(jù)2010版《中國藥典》白芷[11]項下歐前胡素的含量測定方法，同時測定歐前胡素、異歐前胡素的含量，進行了系統(tǒng)適用性試驗，調(diào)整了流動相比例，由原來甲醇與水的比例由55:45調(diào)整為70:30。能同時測定歐前胡素、異歐前胡素的含量，而且測定分析時間從原來1 h縮短至12 min，提高了測定分析的工作效率。

筆者結(jié)合文獻并實驗研究了白芷的主要活性成分。本研究采用了索氏提取白芷中的香豆素，考慮到白芷提取的香豆素廣泛用于中醫(yī)藥，關(guān)系人類健康，筆者改用了乙醇作為提取溶劑，用紫外-可見分光光度法測定了白芷中總香豆素的含量為0.533%。并采用HPLC同時測定歐前胡素、異歐前胡素含量分別為0.092%、0.094%。盡管用乙醇作為白芷中的提取溶劑時，總香豆素包括歐前胡素、異歐前胡素的含量比用甲醇作為溶劑時有所降低，但使用更安全。其成分和含量分析可以為今后在治療白癜風中白芷的主要作用成分和白芷復方軟膏制劑用量或者規(guī)格的選擇提供參考依據(jù)。

[1] 吳媛媛,蔣桂華,馬逾英,等.白芷的藥理作用研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(3):625-627.

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[11] 國家藥典委員會.中國藥典(Ⅰ部)[M].北京:化學工業(yè)出版社,2010:98.

CONTENT DETERMINATION OF TOTAL COUMARINS, IMPERATORIN AND ISOIMPERATORIN IN ANGELICAE DAHURICAE DECOCTION PIECES

*XIE Ru-sheng1, YE Yan-zhu2, PAN Ai-ping1, WU Shui-hua1

(1. Fujian Vocational College of Bioengineering, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2. Fujian Institute of Education, Fuzhou, Fujian 350002, China)

：To understand the role and dosage in the treatment of vitiligo by determining the contents of total coumarins, imperatofin and isoimperatorin in Angelicae Dahuricae decoction pieces.: The content of coumarins was measured by UV-VIS spectrophotometry, the contents of imperatofin and isoimperatorin were measured by HPLC with a Zorbax XB-C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) column, a mobile phase of methanol-water volume ratio as 70:30, a detection wavelength of 300 nm and a flow rate of 1 mL/min.：The results showed that imperatorin and isoimperatorin were in good linearity within certain ranges.: The method is rapid, simple and accurate for the content determination of imperatorin and isoimperatorin in Angelicae Dahuricae decoction pieces, and will provide a reference basis on the role and dosage of in the treatment of vitiligo.

Angelicae Dahuricae decoction pieces; imperatorin; isoimperatorin; determination

R282

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2014.06.019

1674-8085(2014)06-0088-04

2014-08-15；

2014-10-19

福建省教育廳A類科技項目(JA11336)

*謝茹勝(1978-)，女，福建龍海人，講師，主要從事分析化學的研究(E-mail:xierusheng78@163.com）;

葉燕珠(1979-)，女，福建南安人，講師，主要從事結(jié)構(gòu)化學的研究(E-mail:29713222@qq.com）;

潘愛萍(1974-)，女，福建福州人，講師，主要從事藥物化學的研究(E-mail:229878284@qq.com）;

吳水華(1978-)，女，福建龍巖人，講師，主要從事中藥藥物分析的研究(E-mail:47287499@qq.com）