劉 征， 范 飛， 王 歡， 徐奕昊， 田 樂(lè), 尤建軍， 王 盛， 李戰(zhàn)強(qiáng)， 張 波

實(shí)驗(yàn)研究

A型肉毒毒素對(duì)兔植皮后皮片收縮相關(guān)因素的影響

劉 征， 范 飛， 王 歡， 徐奕昊， 田 樂(lè), 尤建軍， 王 盛， 李戰(zhàn)強(qiáng)， 張 波

目的研究A 型肉毒毒素對(duì)兔植皮術(shù)后皮片收縮的相關(guān)因素影響。方法于兔背部沿脊柱兩側(cè)對(duì)稱地制備兩排共4個(gè)2 cm×2 cm正方形供皮區(qū)，切取全厚皮片，共形成20個(gè)創(chuàng)面。每只兔背部隨機(jī)選取2個(gè)創(chuàng)面皮下注射A型肉毒毒素5 U，此為A組，共10個(gè)創(chuàng)面；其余未注射A型肉毒毒素的創(chuàng)面為B組。術(shù)后12 d，大體觀察切口愈合及植皮成活情況。觀察組織的HE染色標(biāo)本中炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠原纖維的變化及免疫組織化學(xué)染色標(biāo)本中α-SMA表達(dá)；測(cè)量每張圖片α-SMA的積分光密度值。結(jié)果大體觀察A組與B組切口愈合及皮片成活無(wú)明顯差異。光鏡下，觀察A組較B組真皮中炎癥細(xì)胞減少，膠原纖維相對(duì)細(xì)小、致密度下降，排列較規(guī)則，大體走向一致；成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，較分散。A組與B組α-SMA的積分光密度值組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)，A組α-SMA的表達(dá)較B組明顯減少。結(jié)論A型肉毒毒素的注射不影響植皮的正常成活及切口愈合?？赏ㄟ^(guò)減少收縮過(guò)程中的成纖維細(xì)胞的數(shù)量、膠原的合成與沉積及炎癥細(xì)胞的生成，以減少肌成纖維細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)，達(dá)到抑制皮片收縮的目的。

植皮術(shù)； 皮片收縮； A 型肉毒毒素； 肌成纖維細(xì)胞； α-平滑肌肌動(dòng)蛋白

A 型肉毒毒素是肉毒梭菌產(chǎn)生的一種外毒素, 主要作用于膽堿運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢，使肌肉麻痹,目前已被廣泛用于治療面部除皺、咬肌肥大、局部多汗癥等。研究發(fā)現(xiàn),A型肉毒毒素作用于肌成纖維細(xì)胞，對(duì)增生性瘢痕與瘢痕疙瘩有一定的預(yù)防與治療作用[1]。大面積燒傷或創(chuàng)傷治療的患者皮膚缺損通常涉及植皮,植皮后的皮片攣縮影響術(shù)后效果，限制其應(yīng)用。自2013年6月至2014年2月，筆者對(duì)A型肉毒毒素注射兔植皮術(shù)后皮片的收縮部分相關(guān)因素的影響進(jìn)行研究,并探討其可能的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料來(lái)源

健康家兔5只，月齡6個(gè)月。體質(zhì)量(2600±200) g。由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。家兔實(shí)驗(yàn)前1周單籠喂養(yǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型的制備 將家兔以速眠新肌肉注射麻醉(每100 g注射0.2 ml)，電動(dòng)去毛機(jī)備背部皮膚，以預(yù)制好的模板于兔背部沿脊柱兩側(cè)用亞甲藍(lán)各制備兩排共4個(gè)2 cm×2 cm正方形供皮區(qū)，每個(gè)供區(qū)間隔4 cm的正常皮膚，切取全厚皮片，深至肉膜層，注意保持肉膜層完整，供皮區(qū)共形成20個(gè)創(chuàng)面。于每只兔背部隨機(jī)選取2個(gè)創(chuàng)面，每個(gè)創(chuàng)面皮下注射A型肉毒毒素(美國(guó)ALLERGAN公司， 100 U/支)5 U，此為A組；未注射A型肉毒毒素的創(chuàng)面為B組。將每只兔1～5編號(hào)。將切取的皮片隨機(jī)逐一植于供皮區(qū)的創(chuàng)面上，每個(gè)創(chuàng)面嚴(yán)格止血，3-0絲線間斷縫合。術(shù)后常規(guī)單籠飼養(yǎng)，肌肉注射青霉素80萬(wàn)U，每天2次，持續(xù)3 d。定期觀察植皮區(qū)的成活情況。12 d后，切除植皮區(qū)的全層皮膚及部分皮下組織，10%甲醛固定。組織塊經(jīng)石蠟包埋后,做常規(guī)切片，HE染色，免疫組化染色，光鏡下觀察組織學(xué)變化。

2.2 HE染色 4 μm切片,脫蠟,蘇木精染液染色15 min,0.5%鹽酸乙醇分化,流水沖洗后,0.5%伊紅染液染色30 s,逐級(jí)乙醇脫水,二甲苯透明,樹膠封片,光鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

2.3 免疫組織化 4 μm切片,脫蠟,3%過(guò)氧化氫室溫孵育封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶,微波熱修復(fù)3 min,用正常羊血清1∶9室溫孵育30 min,以封閉非特異性抗原,加入小鼠抗兔α-SMA單克隆抗體(美國(guó)SIGMA公司, 工作濃度為1∶1200),37 ℃孵育90 min,復(fù)溫后加辣根過(guò)氧化酶HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG(美國(guó)GBI公司),37 ℃靜置20 min,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,脫水封片,顯微鏡下觀察，對(duì)免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。每個(gè)皮片均為4張切片，所有切片均在同一放大倍數(shù)(×200)、同一光強(qiáng)度下測(cè)量，每個(gè)切片5個(gè)視野，采用IPP 6.0圖像分析軟件分析肌成纖維細(xì)胞內(nèi)α-SMA積分光密度值。

3 結(jié)果

3.1 大體觀察 術(shù)后皮片生長(zhǎng)良好，術(shù)后9 d，A組2、4號(hào)兔右下方植皮壞死，術(shù)后12 d，2、4號(hào)兔右下方皮片脫落,其余均生長(zhǎng)良好，切口愈合良好，無(wú)感染、滲出、缺血或壞死，A型肉毒毒素注射未影響植皮的正常成活。

3.2 組織切片觀察 光鏡下觀察A組真皮中有炎癥細(xì)胞較少，膠原纖維相對(duì)細(xì)小、致密度下降，排列較規(guī)則，大體走向一致(圖1a，b)。成纖維細(xì)胞數(shù)量較少；術(shù)后12 d組織切片HE染色B組與A組對(duì)比可見，光鏡下觀察B組真皮中有大量炎癥細(xì)胞，含大量排列致密、粗大的膠原纖維，排列混亂(圖1c，d)。成纖維細(xì)胞較多，胞體較大，胞核呈圓形或橢圓形，著色較深。表皮生長(zhǎng)，真皮層厚度及皮膚附屬器未見明顯差別。

3.3 α-SMA免疫組織化學(xué)積分光密度值 術(shù)后12 d組織切片中可見α-SMA在肌成纖維細(xì)胞胞漿中可見棕黃色陽(yáng)性染色(圖2)，測(cè)量棕黃色顆粒的積分光密度值，通過(guò)積分光密度值反應(yīng)組織中肌成纖維細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)量。兩組α-SMA的積分光密度值組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)，A組α-SMA的表達(dá)較B組明顯減少(表1)。

4 討論

植皮收縮發(fā)生在兩個(gè)階段。當(dāng)皮膚第1次取自其供區(qū)，其經(jīng)歷了即時(shí)的尺寸減小，簡(jiǎn)稱作為早期收縮，早期收縮已發(fā)現(xiàn)9%～22%取決于皮片厚度，并且被認(rèn)為是由真皮彈性纖維導(dǎo)致的。當(dāng)皮片植入受區(qū)，進(jìn)入晚期收縮。此收縮過(guò)程涉及一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子之間的相互作用。成纖維細(xì)胞在皮片收縮過(guò)程中扮演著早期動(dòng)力細(xì)胞，可促使皮片收縮。在皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程中成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞同時(shí)具有成纖維細(xì)胞特性和平滑肌細(xì)胞固有的收縮特性[2]。肌成纖維細(xì)胞是一類具有明顯收縮機(jī)能的成纖維細(xì)胞，有別于傳統(tǒng)的成纖維細(xì)胞，其胞質(zhì)內(nèi)含有大量的微絲與散在的微管，與鄰近細(xì)胞形成橋粒與縫隙連接，并與周圍基質(zhì)通過(guò)纖維連接蛋白形成連接，細(xì)胞的收縮反應(yīng)可借這些結(jié)構(gòu)傳遞到附近的細(xì)胞與基質(zhì)中, 形成細(xì)胞-細(xì)胞之間和細(xì)胞-基質(zhì)之間的聯(lián)系，產(chǎn)生同步活動(dòng)，大量肉芽組織收縮,成為收縮動(dòng)力細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面形成的早期并沒(méi)有微絲的存在，所以肌成纖維細(xì)胞不是創(chuàng)面收縮的始動(dòng)因素, 但參與了創(chuàng)面收縮過(guò)程,是創(chuàng)面收縮的直接動(dòng)力, 眾多肌成纖維細(xì)胞主動(dòng)收縮并帶動(dòng)周圍基質(zhì)可導(dǎo)致創(chuàng)面收縮[3]。α-SMA為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，α-SMA的表達(dá)與肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)，并區(qū)別于成纖維細(xì)胞。近年的研究表明, 在有收縮特性的病理組織中常見α-SMA 表達(dá)增加。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，組織的收縮與α-SMA的表達(dá)呈正相關(guān), 抑制α- SMA的的表達(dá)有可能降低收縮[4]。在創(chuàng)傷后新生肉芽組織開始生長(zhǎng)時(shí)，即能觀察到肌成纖維細(xì)胞, 隨后細(xì)胞數(shù)量逐漸增多并達(dá)到最高峰, 然后肌成纖維細(xì)胞凋亡增加, 最后消失于穩(wěn)定的瘢痕組織中。傷后7 d左右傷口周圍的成纖維細(xì)胞增生,成纖維細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化肌成纖維細(xì)胞。隨后，肌成纖維細(xì)胞繼續(xù)遷移、爬行，與成纖維細(xì)胞共同參與創(chuàng)面收縮及肉芽組織的生長(zhǎng)及塑形。傷后12 d, α-SMA表達(dá)高峰時(shí), 肌成纖維細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡;傷后16 d, 當(dāng)傷口閉合時(shí), 發(fā)生凋亡的肌成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯增加, 在傷后20 d達(dá)高峰。大量成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞通過(guò)凋亡減少或消失。當(dāng)傷口上皮化后，收縮停止，α-SMA消失[5]。肌成纖維細(xì)胞還可以通過(guò)一些潛在的機(jī)制促進(jìn)創(chuàng)口的愈合，諸如呈遞抗原，分泌對(duì)創(chuàng)口愈合必須的趨化因子、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，促進(jìn)血管發(fā)生、分化，參與創(chuàng)面收縮[6]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子可以直接誘導(dǎo)培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，增加α-SMA 表達(dá)，上調(diào)成纖維細(xì)胞中膠原蛋白的表達(dá)，在體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子均是促使成纖維細(xì)胞變成肌成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)的最主要因素，增強(qiáng)肌成纖維細(xì)胞的遷移和收縮性能[7]。因此，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子作為組織修復(fù)和產(chǎn)生組織纖維化的關(guān)鍵因子。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子作為成纖維細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞分裂的趨化劑，也積極作用于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子合成和釋放，不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附和增長(zhǎng)，也導(dǎo)致膠原的過(guò)度沉積。作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子功能下游調(diào)節(jié)因子，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子還可以獨(dú)立調(diào)解瘢痕的增生和纖維化，作用于收縮過(guò)程，成纖維細(xì)胞的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子增加導(dǎo)致增生性瘢痕[8]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子刺激結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子反過(guò)來(lái)會(huì)影響膠原蛋白沉積，進(jìn)而影響收縮過(guò)程。

圖1 兩組皮膚組織HE染色(×100) a.A組表皮層與真皮層 b.A組真皮層 c.B組表皮層與真皮層 d.B組真皮層圖2 兩組皮膚組織α-SMA蛋白免疫組化染色(×200) a.A組 b.B組

Fig1 Histological observation by HE (×100). a. epidermis and dermis of Group A. b. dermis of Group A. c. epidermis and dermis of Group B. d. dermis of Group B.Fig2 Histological observation by α-SMA immumohistochemical staining (×200). a. Group A. b. Group B.

表1 兩組α-SMA積分光密度值

組別 a-SMA積分光密度值A(chǔ)35165153.72±17693211.72B47508163.92±19803028.64

A型肉毒毒素已經(jīng)應(yīng)用于增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的治療，臨床治療效果較理想[1]。A型肉毒毒素可對(duì)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)周期造成影響，使成纖維細(xì)胞更多停滯在靜止期，較少進(jìn)入增殖期，有效地抑制了成纖維細(xì)胞的增長(zhǎng)，且合成能力將明顯下降，作用于收縮過(guò)程，在某種程度上起到抑制瘢痕的作用；對(duì)瘢痕組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的生成也起到了抑制的關(guān)鍵作用[9]。還可能抑制瘢痕組織中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的生成[10]。A型肉毒毒素不影響創(chuàng)面愈合，可減少兔耳增生瘢痕中SP、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和α-SMA的mRNA及蛋白的表達(dá)[11]。在攣縮性瘢痕的作用機(jī)制的探索性研究中發(fā)現(xiàn)，注射A型肉毒毒素后6個(gè)月,瘢痕表面皺縮,周圍皮膚明顯松弛,質(zhì)軟，可能與A型肉毒毒素能夠抑制瘢痕內(nèi)成纖維細(xì)胞中α-SMA及肌球蛋白-Ⅱ的表達(dá)有關(guān)[12]?；谝陨涎芯浚梢源_定A型肉毒毒素可以影響收縮過(guò)程中的成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞的表達(dá)及多種細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，但具體機(jī)制有待于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究。

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InfluenceofbotulinumtoxintypeAoncorrelationfactorsofskingraftcontractioninrabbit

LIUZheng,FANFei,WANGHuan,etal.

(the12thDepartmentofPlasticSurgery,PlasticSurgeryHospital,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100144,China)

ObjectiveTo investigate the influences of botulinum toxin type A on expression of skin graft contraction.MethodsFour 2 cm×2 cm square donor sites from each rabbit were made on the bilateral back along the spine to make 20 wounds by cutting full thickness skin. Two wounds of each rabbit were chosen randomly to form the Group A (10), while the other two were the Group B (10). Wounds in the Group A were treated with 5 U botulinum toxin A and those in the Group B were treated without botulinum toxin A. The wound healing and survival of grafted skin were observed and inflammatory cells, fibroblasts and changes of collagen fiber were detected by HE and the expression of α-SMA was measured by IHC, the integrated optical density value of α-SMA was also detected.ResultsCompared with the Group B, the wounds healing and survival of grafted skin in Group A had no significant difference. Compared with the Group B, the inflammatory cells in the Group A was less, collagen fibers were relatively thinner and smaller with decreased density and regular alinement at the same direction and fibroblasts were less and scattered under light microscope. The integrated optical density value of α-SMA between the two groups had significant difference (P= 0.003). The expression of α-SMA in the Group A was weaker than that in the Group B.ConclusionThe effect of BTXA can reduce the number of fibroblasts, density of collagen fiber and expression of α-SMA in the contraction of process of grafted skin.

Skin grafting; Flap contraction; Botulinum toxin type A; Myofibroblasts; α-smooth muscle actin

100144 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院 整形十二科

劉 征(1986-)，女，遼寧阜新人，碩士研究生.

范 飛，100144，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院 整形十二科，電子信箱：fanfeiplastics@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.07.020

R622.1

A

1673-7040(2014)07-0438-04

2014-03-10)